Summary

Övervakning bakteriell kolonisering och underhåll på Arabidopsis thaliana rötter i en flytande hydroponiska system

Published: May 28, 2019
doi:

Summary

Här beskriver vi en hydroponiska växttillväxt analys för att kvantifiera Art närvaro och visualisera den rumsliga fördelningen av bakterier under initial kolonisering av växtrötter och efter deras överföring till olika tillväxt miljöer.

Abstract

Bakterier bildar komplexa rhizosfären mikrobiomes formad av samverkande mikrober, större organismer, och den abiotiska miljön. Under laboratorieförhållanden, rhizosfären kolonisering av växttillväxt främjande bakterier (pgpb) kan öka hälsan eller utvecklingen av värdväxter i förhållande till okoloniserade växter. Men i Fältinställningar, bakteriella behandlingar med PGPB ger ofta inte betydande fördelar för grödor. En förklaring är att detta kan bero på förlust av PGPB under interaktioner med endogena jord mikrober över livslängden på växten. Denna möjlighet har varit svårt att bekräfta, eftersom de flesta studier fokuserar på den initiala koloniseringen snarare än underhåll av pgpb inom rhizosfären samhällen. Det är en hypotes här att församlingen, samexistens, och underhåll av bakteriesamhällen formas av deterministiska funktioner i rhizosfären microenvironment, och att dessa interaktioner kan påverka pgpb överlevnad i inhemska inställningar. För att studera dessa beteenden, en hydroponiska växt-Tillväxtanalys är optimerad med Arabidopsis thaliana att kvantifiera och visualisera den rumsliga fördelningen av bakterier under initial kolonisering av växtrötter och efter överföring till olika tillväxt Miljöer. Detta Systems reproducerbarhet och nytta är sedan valideras med den väl studerade PGPB Pseudomonas simiae. För att undersöka hur närvaron av flera bakteriearter kan påverka kolonisering och underhåll dynamik på växten roten, en modell gemenskap från tre bakteriestammar (en Arthrobacter, Curtobacterium, och microbacterium arter) som ursprungligen isolerats från A. thaliana rhizosfären är konstruerad. Det visas att närvaron av dessa olika bakteriearter kan mätas med hjälp av denna hydroponiska Plant-maintanence assay, som ger ett alternativ till sekvenserings-baserade bakteriella samhällsstudier. Framtida studier med detta system kan förbättra förståelsen av bakterie beteende i flerartsbaserade växt mikrobiomer över tid och i förändrade miljöförhållanden.

Introduction

Gröda förstörelse av bakterie-och svampsjukdomar resulterar i sänkt livsmedelsproduktion och kan allvarligt störa den globala stabiliteten1. Baserat på upptäckten att mikrober i suppressiva jordar är ansvariga för att öka växthälsan2, forskare har frågat om växten mikrobiomet kan utnyttjas för att stödja växternas tillväxt genom att ändra förekomst och överflöd av särskilda bakteriearter3. Bakterier som finns till stöd i växternas tillväxt eller utveckling benämns kollektivt växttillväxt främjande bakterier (PGPB). På senare tid har studier skiftat från att bara identifiera potentiella pgpb att förstå hur interkingdom interaktioner i jorden, runt rötter, eller i rhizosfären (området direkt omgivande och inklusive roten ytan) kan påverka pgpb verksamhet4.

Rhizosphere kolonisering av PGPB kan öka hälsan eller utvecklingen av värdväxter som svar på olika stressorer i förhållande till okoloniserade växter5. Emellertid, resultaten är ofta mer varierande i inhemska markförhållanden jämfört med de som observerats i den nära kontrollerade växthus-och laboratorie inställningar6. En hypotes för denna skillnad är att tillväxten eller beteendet hos pgpb kan hämmas av infödda jordbakterier eller svampar i fälten7,8. Gynnsamma effekter av rhizosfären bakterier beror i allmänhet på förmågan hos bakterierna att 1) lokalisera och gå mot roten, 2) kolonisera roten genom biofilm formation, och 3) interagera med värd växten eller patogener via produktion av små molekyl metaboliter7,9. Någon av dessa kolonisering beteenden kan påverkas av närvaron och aktiviteten av angränsande mikrober10.

Vi designade ett system för att kvantifiera och visualisera dessa distinkta bakteriella koloniseringsstadier av rhizosfären (figur 1). Detta tillvägagångssätt kommer att underlätta studier som undersöker varför långsiktigt PGPB underhåll ibland inte observeras efter överföring av växter till nya miljöer, såsom vid plantering av pre-inokulerade plantor. Arabidopsis thaliana som valdes som en växt modell på grund av dess omfattande användning i laboratoriestudier samt de rikliga data som finns om dess mikrobiella interaktioner11. Det finns tre stadier i systemet: 1) A. thaliana Growth, 2) bakteriell kolonisering, och 3) bakterie underhåll (se figur 1). Eftersom a. thaliana är en markbunden anläggning, var det viktigt att se till att det inte var lidande onödig vattenstress i hydroponiska systemet12. Inspirerad av de metoder som används av Haney et al.13, plantorna odlas på plast mesh för att separera skott från flytande odlingssubstrat. Detta system verkar inte äventyra hälsan och utvecklingen av anläggningen värd, och det förbättrar en. thaliana tillväxt i flytande11. När anläggningen skjuter flyter över ytan, rötterna är fullt utsatta för kolonisering av bakterier inokuleras i flytande bakterietillväxt medium. Detta tillåter bakterier av intresse som skall undersökas för kolonisering i näringsämnen som är mest gynnsam för tillväxt, medan sedan skiftande förhållanden för att tillåta växten att fortsätta växa i ett näringsämne medium som utformats för att stödja dess tillväxt. Båda stegen inkluderar stadig skakning för att förhindra anoxia av roten13. Bakterier kan visualiseras eller kvantifieras från växternas rötter efter överföring från antingen koloniseringsmediet eller underhålls mediet. Detta hydroponiska systemet är mycket flexibelt, vilket gör att experimentella förhållanden och tillämpade spänningar lätt kan ändras beroende på intressen av forskarna.

Denna beskrivna metod är viktig i samband med den större kroppen av litteratur om växt-Microbe interaktioner eftersom det ger ett robust system för att studera dessa interaktioner på roten ytan samtidigt som den är anpassningsbar till tillväxt preferenser olika bakterier. Växtbiologi Labs utför ofta växt-Microbe kolonisering experiment på fast agar, vilket möjliggör endast planar rörelse (om det) av bakterier samtidigt som kräver potentiellt destruktiva manipulation av växter under efterföljande överföring. I kontrast, mikrobiologi Labs har ofta prioriterat hälsan hos bakterierna i sina experiment, till nackdel för växterna14,15. Dessa olika prioriteringar av växt-och mikrobiologi fokuserade laboratorier har historiskt gjort det svårt att jämföra resultat mellan dessa grupper, eftersom varje typiskt optimerar experimentella förhållanden för att optimera deras organism av intresse15. Den flytande-mesh-växt-tillväxtsystem som beskrivs här förhindrar full Plant nedsänkning, en anmärkningsvärd fördel för tidigare mikrobiologi orienterade studier, samtidigt också tillfälligt optimera tillväxten och överlevnaden av bakterier för att underlätta kolonisering. Sålunda, det test som vi presenterar här kan ta upp farhågor från både växt biologer (om över-hydrering och taktil manipulation av anläggningen) samtidigt som uppfyller kriterierna för mikrobiologer (möjliggör olika bakterietillväxt villkor och flera Artens interaktioner)7. Detta protokoll är utformat för att vara anpassningsbar för användning med olika bakterier, växter och miljöförhållanden.

Protocol

Anmärkning: den experimentella installationen beskrivs för tydlighetens skull och används för att generera representativa resultat som ingår i denna rapport, men villkoren kan ändras efter behov. Alla steg bör utföras med hjälp av PPE och efter institutionella och federala reccomendations för säkerhet, enligt BSL status av de bakterier som används. 1. karakterisering av bakterier Bestäm morfologin av bakterier på odlingssubstrat agar plattan. Omsuspendera cellerna vid e…

Representative Results

Den väl karaktäriserade PGPB P. simiae WCS417r är känd för att kolonisera rötterna av A. thaliana i hydroponiska kulturen. Denna naturligt fluorescerande bakterie kan enkelt visualiseras med hjälp av mikroskopi på rötterna av plantor efter kolonisation (figur 2). Även om det är möjligt att avbilda hela längden av dessa A. thaliana plantor “(4-6 mm längd) rötter, gör så för många växter skulle ta en prohibitiv tid…

Discussion

Växter i alla miljöer samverkar med tusentals till miljontals olika bakterier och svampar5,7. Dessa interaktioner kan antingen negativt och positivt påverka växthälsan, med potentiella effekter på skördeavkastning och livsmedelsproduktion. Nyligen arbete tyder också på att varierande kolonisering av grödor av PGPBs kan redogöra för oförutsägbar växt storlek och skördeavkastning i fältförsök22. Förstå mekanismerna bakom…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av forskningsmedel från Institutionen för energi biologisk och miljö forskning (DOE-BER 0000217519 till E.A.S.), National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 till E. A. S). SLH stöddes också av National Science Foundation Graduate Research Fellowship program. Vi tackar Dr Jeffery Dangl för att ge bakteriestammar och ovärderlig insikt. Vi tackar Dr Andrew Klein och Matthew J. Powers för experimentella förslag. Slutligen vill SLH tacka anslutningar på sociala medier för att påminna oss om att spridning av vetenskap är ett privilegium och ett ansvar, särskilt genom kreativa och tillgängliga medel.

Materials

Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes any N/A
24-well plates BD Falcon 1801343
Aeraseal Excel Scientific BE255A2
Autoclave any N/A
Bacteria of Interest any N/A Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred
BactoAgar BD 2306428; REF 214010
bleach any N/A
Conviron any N/A Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic any N/A
Ethanol any N/A
Flame any N/A
Forceps any N/A
Incubator any N/A At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid any N/A
Lennox LB Broth RPI L24066-1000.0
Microcentrifuge any N/A
Micropipetters any N/A Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence) any N/A Could be light if best definition not important
MS Salts + MES RPI M70300-50.0
Orbital Plate Shaker any N/A Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes any N/A 50 mL total volume
Reservoirs any N/A
Spectrophotometer any N/A
Standard Hole Punch any N/A Approximately 7mm punch diameter
Sterile water any N/A
Surgical Tape 3M MMM1538-1
Teflon Mesh McMaster-Carr 1100t41
Ultrasonicator any N/A
Vortex Mixer any N/A
X-gal GoldBio x4281c other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment any N/A For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II Excel Scientific FE124F
Glass beads any N/A
Multipetter/Repetter any N/A
Sterile 96-well plates any N/A For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds any N/A We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017

References

  1. Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
  2. Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
  3. Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
  4. Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
  5. Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
  6. Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
  7. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  8. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
  9. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
  10. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
  11. Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. 유전학. 208 (4), 1337-1349 (2018).
  12. Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
  13. Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
  14. Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
  15. Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
  16. Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
  17. Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
  18. Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
  19. Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
  20. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
  21. Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
  22. Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
  23. Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
  24. Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
  25. Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
check_url/kr/59517?article_type=t&slug=monitoring-bacterial-colonization-maintenance-on-arabidopsis-thaliana

Play Video

Cite This Article
Harris, S. L., Pelaez, C. A., Shank, E. A. Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System. J. Vis. Exp. (147), e59517, doi:10.3791/59517 (2019).

View Video