En in vitro-batch-kultur model til at estimere virkningerne af interventionelle regimer på human fecal microbiota
Summary
Denne protokol beskriver en in vitro batch-kultur fermenterings system af humant fækal mikrobiota, ved hjælp af inulin (en velkendt prebiotiske og en af de mest udbredte studerede mikrobiota modulatorer) at demonstrere brugen af dette system til at anslå virkningerne af specifikke interventioner på fækal mikrobiota sammensætning og metaboliske aktiviteter.
Abstract
Den nye rolle, som tarm mikrobiomet spiller i flere menneskelige sygdomme, kræver et gennembrud af nye værktøjer, teknikker og teknologier. Sådanne forbedringer er nødvendige for at dechifrere udnyttelsen af mikrobiome modulatorer til gavn for menneskers sundhed. Men den omfattende screening og optimering af modulatorer til validering af mikrobiome modulation og forudsige relaterede sundhedsmæssige fordele kan være praktisk vanskeligt på grund af behovet for et stort antal dyr og/eller menneskelige. Med henblik herpå kan in vitro-eller ex vivo-modeller lette den foreløbige screening af mikrobiome modulatorer. Heri, det er optimeret og demonstreret en ex vivo fækal mikrobiota kultur system, der kan anvendes til at undersøge virkningerne af forskellige interventioner af Gut mikrobiome modulatorer herunder probiotika, prebiotics og andre fødevareingredienser, bortset fra nutraceuticals og narkotika, om mangfoldigheden og sammensætningen af den humane tarm mikrobiota. Inulin, en af de mest udbredte undersøgte prebiotiske forbindelser og mikrobiome modulatorer, bruges som et eksempel her for at undersøge dens virkning på den sunde fækale mikrobiota sammensætning og dens metaboliske aktiviteter, såsom fækal pH og fækale niveauer af organiske syrer herunder laktat og kortkædede fedtsyrer (SCFAs). Protokollen kan være nyttig for undersøgelser, der har til formål at anslå virkningerne af forskellige interventioner af modulatorer på fækale mikrobiota profiler og at forudsige deres sundhedsmæssige konsekvenser.
Introduction
Den humane mikrobiota er et komplekst fællesskab bestående af bakterier, archaea, vira og eukaryote mikrober1, der bebor den menneskelige krop internt og eksternt. Nylige beviser har fastlagt den grundlæggende rolle, som Gut mikrobiota og tarm mikrobiome (hele samlingen af mikrober og deres gener findes i den menneskelige mave-tarmkanalen) i forskellige sygdomme hos mennesker, herunder fedme, diabetes, hjerte-kar-sygdomme, og kræft1,2,3. Derudover producerer de mikroorganismer, der lever i vores tarm, et bredt spektrum af metabolitter, som i væsentlig grad påvirker vores helbred og kan også bidrage til patofysiologien af flere sygdomme samt en række metaboliske funktioner4, 5. unormale ændringer (perturbationer) i sammensætningen og funktionen af denne Gut mikrobielle population er generelt betegnes som “Gut dysbiosis”. Dysbiosis er normalt forbundet med en usund tilstand af værten og dermed kan differentieres fra den normale (homeostatisk) mikrobielle samfund forbundet med en sund kontroltilstand af værten. Specifikke mønstre af Gut mikrobiome dysbiosis findes ofte i forskellige forskellige sygdomme1,2,3,6,7.
Fermentering af ufordøjet mad, især de fermenterbare kulhydrater/fibre, af Gut mikrobiota ikke kun giver energi, men også producerer divergerende metabolitter, herunder kortkædede fedtsyrer (scfas), lactat, formate, carbondioxid, metan, brint og ethanol6. Desuden producerer Gut mikrobiota også en række andre bioaktive stoffer såsom folat, biotin, trimethylamin-N-oxid, serotonin, tryptophan, gamma-aminosmørsyre, dopamin, noradrenalin, acetylcholin, histamin, deoxycholic Acid og 4-ethylphenyl sulfat. Dette sker primært gennem udnyttelse af iboende metaboliske strømme inden for værten-Microbe niche, som bidrager i flere krops processer, metaboliske funktioner og epigenetiske ændringer1,8,9, 10. Virkningerne af forskellige interventioner på sådanne mikrobielle produkter forbliver imidlertid ukendte eller uklare på grund af manglen på enkle, effektive og reproducerbare protokoller. Den menneskelige tarm mikrobiota sammensætning er et yderst komplekst og mangfoldigt økosystem, og derfor er mange spørgsmål om dets rolle i menneskers sundhed og sygdoms patologi stadig ubesvarede. Virkningerne af mange almindelige tarm mikrobiome modulatorer (fx probiotika, prebiotics, antibiotika, fækal transplantation og infektioner) på sammensætningen og metaboliske funktioner i tarm mikrobiota forbliver stort set undvigende. Desuden er undersøgelse og validering af disse virkninger in vivo vanskelig, især fordi de fleste af de næringsstoffer og metabolitter, der produceres af tarmen mikrobiota absorberes eller bortskaffes samtidigt og hurtigt i tarmen; Derfor er det stadig en praktisk udfordring at måle produktionen, mængden og forarbejdningen af disse metabolitter (f. eks. SCFAs) in vivo. Fysiologiske modeller såsom dyr og mennesker er afgørende for at bestemme rollen for Gut-mikrobiom og dets graduering på værts sundheden, men disse kan ikke være egnede til storstilet screening af forskellige typer af mikrobiome modulatorer på grund af etiske, monetære eller tidsmæssige begrænsninger. Med henblik herpå kan in vitro-og/eller ex vivo-modeller, såsom dyrkning af Gut mikrobiota in vitro og derefter intervenere med forskellige mikrobiota-modulatorer, tilbyde tids-og pengebesparende muligheder og kan derfor give mulighed for foreløbig eller storstilet screening af forskellige komponenter (såsom probiotika, prebiotics, og andre interventionelle forbindelser) til at undersøge/forudsige deres virkninger på fækal mikrobiota mangfoldighed, sammensætning og metaboliske profiler. Undersøgelser, der anvender sådanne in vitro-og ex vivo-systemer i tarm mikrobielle stoffer, kan fremme en yderligere forståelse af værts-mikrobiom-interaktioner, som bidrager til at være vært for sundhed og sygdom, og kan også føre til at finde nye terapier, der er målrettet mod mikrobiomet, til forbedre Host sundhed og forebygge og behandle forskellige sygdomme1.
Selv om in vitro Gut mikrobiota kultur systemer ikke rigtig kan replikere de faktiske tarm betingelser, har flere laboratorier bestræbt sig på at udvikle sådanne modeller, hvoraf nogle er blevet fundet praktisk gennemførligt til en vis grad og er blevet anvendt med succes til forskellige formål. En af de seneste Gut modeller er simulatoren af den menneskelige tarm mikrobielle økosystem, som efterligner hele menneskelige mave-tarmkanalen, herunder maven, tyndtarmen, og forskellige regioner i tyktarmen. Men sådanne teknisk komplekse modeller er muligvis ikke tilgængelige for andre forskningsfaciliteter på verdensplan. Der er derfor stadig et kritisk behov for udvikling af nye alternative modeller, der er relativt enkle, overkommelige og praktiske for laboratorier, som studerer mikrobiome modulatorer og deres virkninger på tarm mikrobiota og værts sundhed. Derfor ville brugen af et in vitro (eller ex vivo) fækale mikrobiota-kultur system være nyttigt til at studere virkningerne af sådanne interventioner11,12. Specifikt, virkningen af forskellige prebiotics på mikrobiota fermenterings kapacitet i form af periodiske ændringer i tarm mikrobiota mangfoldighed og sammensætning, fækal pH, og niveauerne af mikrobielle metabolitter, herunder SCFAs og lactat kan undersøgt 13. heri, ved hjælp af inulin (en af de mest udbredte undersøgt prebiotiske komponenter) som et eksempel på mikrobiome modulator, en trin-for-trin protokol af denne simple ex vivo mikrobiota batch-kultur system er beskrevet for at demonstrere dets anvendelse til at anslå ændringer i fækale mikrobiota og mikrobielle metabolitter efter intervention med mikrobiome modulatorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro fækal gylle fermenterings model præsenteret her er en simpel single-batch model til at tilnærme virkningerne af forskellige substrater og mikrobielle stammer (f. eks prebiotics og probiotika) på sammensætningen af human fækal mikrobiota samt dens metaboliske aktiviteter i form af fækal pH og SCFAs niveauer. Resultaterne præsenteres heri viser, at inokulering af inulin nedsætter fækal pH og øger niveauet af SCFAs og lactat i inulin-behandlet fækal model i forhold til ikke-behandlede fækale mikrobiota…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender taknemmeligt støtte fra Center for diabetes, fedme og metabolisme og det kliniske og translationelle videnskabscenter, Wake Forest School of Medicine, Department of Defense finansiering (tilskudsnummer: W81XWH-18-1-0118), Kermit Glenn Phillips II stol i hjerte-kar-medicin; National Institutes of Health finansierede Claude D. Pepper ældre amerikanere Center (finansieret af P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 og det kliniske og translationelle videnskabs Center (klinisk forskningsenhed, finansieret af UL1TR001420), er også heldigvis anerkendt. Vi takker også de frivillige for at levere fækale prøver, og vores andre Lab medlemmer for deres tekniske hjælper under dette eksperiment.
Materials
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).
- Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).
- Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).
- Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).
- Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).
- O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
- Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).
- Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).
- Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).
- Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. , 428474 (2018).
- Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).
- Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).
- Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
- Chen, M. -. H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).
- Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).
- Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).
- Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23 (1), 41-53 (2018).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69 (2017).
