Detta protokoll beskriver ett in vitro-system för jäsning av Human fekal bakterieflora, med hjälp av inulin (en välkänd prebiotika och en av de mest studerade Mikrobiota modulatorer) för att demonstrera användningen av detta system för att uppskatta effekterna av specifika interventioner på fekal bakterieflora sammansättning och metaboliska aktiviteter.
Den framväxande roll Gut mikrobiomet i flera mänskliga sjukdomar kräver ett genombrott av nya verktyg, tekniker och teknik. Sådana förbättringar behövs för att dechiffrera utnyttjandet av mikrobiomet modulatorer för människors hälsa fördelar. Men den storskaliga screening och optimering av modulatorer för att validera mikrobiomet modulering och förutsäga relaterade hälsofördelar kan vara praktiskt taget svårt på grund av behovet av ett stort antal djur och/eller försökspersoner. För detta ändamål kan in vitro-eller ex vivo-modeller underlätta preliminär screening av mikrobiomet modulatorer. Häri, det är optimerat och visat en ex vivo fekal bakterieflora kultur system som kan användas för att undersöka effekterna av olika ingrepp i Gut mikrobiomet modulatorer inklusive probiotika, prebiotika och andra livsmedelsingredienser, bortsett från nutraceuticals och droger, om mångfalden och sammansättningen av den mänskliga Gut bakterieflora. Inulin, en av de mest studerade prebiotiska föreningar och mikrobiomet modulatorer, används som ett exempel här för att undersöka dess effekt på friska fekal bakterieflora sammansättning och dess metaboliska aktiviteter, såsom fekal pH och fekal nivåer av organiska syror inklusive laktat och kortkedjiga fettsyror (SCFAs). Protokollet kan vara användbart för studier som syftar till att uppskatta effekterna av olika interventioner av modulatorer på fekal bakterieflora profiler och att förutsäga deras hälsoeffekter.
Den mänskliga bakterieflora är en komplex gemenskap bestående av bakterier, Archaea, virus och eukaryota mikrober1, som lever i den mänskliga kroppen internt och externt. De senaste bevisen har fastställt den grundläggande roll som Gut bakterieflora och Gut mikrobiomet (hela samlingen av mikrober och deras gener som finns i den mänskliga mag-tarmkanalen) i olika mänskliga sjukdomar, inklusive fetma, diabetes, hjärt-kärlsjukdomar och cancer1,2,3. Dessutom, de mikroorganismer som lever i vår Gut producera ett brett spektrum av metaboliter som signifikant påverkar vår hälsa och kan också bidra till patofysiologin av flera sjukdomar samt en mängd metabola funktioner4, 5. onormala förändringar (perturbationer) i sammansättningen och funktionen av denna Gut mikrobiella populationen betecknas allmänt som “Gut dysbios”. Dysbios är vanligtvis förknippad med ett ohälsosamt tillstånd av värden och därmed kan skiljas från den normala (homeostatiska) mikrobiell gemenskap som är associerad med en hälsosam kontroll tillstånd av värden. Specifika mönster av Gut mikrobiomet dysbios finns ofta i olika olika sjukdomar1,2,3,6,7.
Jäsning av osmält mat, särskilt jäsbara kolhydrater/fibrer, genom tarmen bakterieflora inte bara ger energi utan också producerar olika metaboliter inklusive kortkedjiga fettsyror (scfas), laktat, formate, koldioxid, metan, väte och etanol6. Dessutom, den Gut bakterieflora producerar också ett antal andra bioaktiva substanser såsom folat, biotin, trimethylamine-N-oxid, serotonin, tryptofan, gamma-aminosmörsyra, dopamin, noradrenalin, acetylkolin, histamin, deoxycholsyra och 4-etylfenylsulfat. Detta sker främst genom utnyttjande av inneboende metaboliska flöden inom värd-Microbe nisch, som bidrar i flera kroppens processer, metaboliska funktioner och epigenetiska förändringar1,8,9, 10. Effekterna av olika interventioner på sådana mikrobiella produkter förblir dock otydliga eller oklara på grund av bristen på enkla, effektiva och reproducerbara protokoll. Sammansättningen av Human Gut bakterieflora är ett mycket komplext och mångsidigt ekosystem, och därför är många frågor om dess roll i människans hälsa och sjukdoms patologi fortfarande obesvarade. Effekterna av många vanliga Gut mikrobiomet modulatorer (t. ex., probiotika, prebiotika, antibiotika, fekal transplantation och infektioner) på sammansättningen och metaboliska funktioner i tarmbakterieflora fortfarande i stort sett svårfångade. Dessutom är det svårt att undersöka och validera dessa effekter in vivo, särskilt eftersom de flesta av de näringsämnen och metaboliter som produceras i tarmfloran absorberas eller bortskaffas samtidigt och snabbt i tarmen. Därför är det fortfarande en praktisk utmaning att mäta produktionen, mängden och bearbetningen av dessa metaboliter (t. ex. SCFAs) in vivo. Faktum är att fysiologiska modeller som djur och försökspersoner är avgörande för att fastställa den roll som Gut mikrobiomet och dess modulering på värd hälsan, men dessa kanske inte lämpar sig för storskalig screening av olika typer av mikrobiomet modulatorer på grund av etiska, monetära eller tidsbegränsningar. I detta syfte kan in vitro-och/eller ex vivo-modeller, såsom odling av tarmfloran in vitro och sedan ingripa med olika Mikrobiota-modulatorer, erbjuda tids-och penga sparande möjligheter och kan därför möjliggöra preliminär eller storskalig screening av olika komponenter (såsom probiotika, prebiotika, och andra interventionella föreningar) att undersöka/förutsäga deras effekter på fekal bakterieflora mångfald, sammansättning och metabola profiler. Studier som använder sådana in vitro-och ex vivo-system i tarmen mikrobiome kan underlätta ytterligare förståelse av värd-mikrobiomet interaktioner som bidrar till värd hälsa och sjukdom, och kan också leda till att hitta nya terapier som riktar sig till mikrobiomet att förbättra värd hälsa och förebygga och behandla olika sjukdomar1.
Även om kultur systemen in vitro Gut bakterieflora inte riktigt kan replikera de faktiska tarm förhållandena har flera laboratorier strävat efter att utveckla sådana modeller, av vilka några har hittats praktiskt i viss utsträckning och har använts framgångsrikt för olika ändamål. En av de senaste Gut modellerna är simulatorn av människans intestinal mikrobiella ekosystem, som härmar hela människans mag-tarmkanalen, inklusive magen, tunntarm, och olika regioner i tjocktarmen. Sådana tekniskt komplicerade modeller kan dock inte vara tillgängliga för andra forskningsanläggningar över hela världen. Därför finns det fortfarande ett kritiskt behov av utveckling av nya alternativa modeller som är relativt enkla, överkomliga och praktiska för laboratorier som studerar mikrobiomet modulatorer och deras effekter på tarmfloran och värd hälsan. Därför skulle användningen av ett in vitro-(eller ex vivo) fekalt Mikrobiota-kultursystem vara användbart för att studera effekterna av sådana interventioner11,12. Specifikt, effekten av olika prebiotika på bakterieflora jäsning kapacitet i form av periodiska förändringar i tarmfloran mångfald och sammansättning, fekal pH, och nivåerna av mikrobiella metaboliter inklusive SCFAs och laktat kan studeras 13. häri, med hjälp av inulin (en av de mest studerade prebiotiska komponenter) som ett exempel på mikrobiomet modulator, ett steg-för-steg-protokoll i detta enkla ex vivo bakterieflora batch-kultursystem beskrivs för att visa dess användning för att uppskatta förändringar i fekal bakterieflora och mikrobiella metaboliter efter intervention med mikrobiomet modulatorer.
Den in vitro fekal flytgödsel jäsning modell som presenteras här är en enkel enda sats modell för att approximera effekterna av olika substrat och mikrobiella stammar (t. ex., prebiotika och probiotika) på sammansättningen av mänskliga fekal bakterieflora samt dess metaboliska aktiviteter i form av fekal pH och SCFAs nivåer. De resultat som presenteras häri visar att inympningen av inulin minskar fekal pH och signifikant ökar nivåerna av SCFAs och laktat i inulin-behandlade fekal prov jämfört med icke-behan…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner tacksamt finansiering stöd från centrum för diabetes, fetma och metabolism och den kliniska och translationella Science Center, Wake Forest School of Medicine, Department of Defense finansiering (Grant Number: W81XWH-18-1-0118), den Kermit Glenn Phillips II stol i kardiovaskulär medicin; de nationella instituten för hälso-finansierade Claude D. Pepper äldre amerikaner Center (finansierat av P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 och den kliniska och translationella Science Center (klinisk forskningsenhet, finansierad av UL1TR001420), är också tack och lov erkänt. Vi tackar också volontärer för att tillhandahålla fekal prover, och våra andra Lab medlemmar för deras tekniska hjälper under detta experiment.
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
0.22 µm membrane filter | |||
AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
Bottle filter | Corning | ||
Cheesecloth | |||
Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
pH meter | |||
Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
Vortex | Thermoscientific | ||
Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |