En prosedyre er presentert for å visualisere protein kinase en virksomhet i hodet fast, oppfører mus. En forbedret A-kinase aktivitet reporter, tAKARα, uttrykkes i kortikale neurons og gjort tilgjengelig for Imaging gjennom et skallen vindu. To-Foton fluorescens levetid Imaging mikroskopi brukes til å visualisere PKA aktiviteter in vivo under tvungen bevegelse.
NeuroModulation utøver kraftig kontroll over hjernens funksjon. Dysfunksjon av neuromodulatoriske systemer resulterer i nevrologiske og psykiatriske lidelser. Til tross for deres betydning, teknologier for sporing neuromodulatoriske hendelser med mobilnettet oppløsning er bare begynnelsen å dukke opp. Neuromodulatorer, som Dopamin, noradrenalin, acetylkolin, og serotonin, utløse intracellulære signalering hendelser via sine respektive G protein-koplet reseptorer til modulere neuronal excitability, Synaptic kommunikasjon og andre neuronal funksjoner, og dermed regulere informasjonsbehandling i det neuronal nettverket. De nevnte neuromodulatorer møtes på cAMP/protein kinase A (PKA). Derfor, in vivo PKA Imaging med single-celle oppløsning ble utviklet som en avlesning for neuromodulatoriske hendelser på en måte som tilsvarer kalsium Imaging for neuronal elektriske aktiviteter. Her presenteres en metode for å visualisere PKA aktivitet på nivået av individuelle neurons i cortex på hodet faste oppfører mus. For å gjøre dette, en forbedret A-kinase aktivitet reporter (AKAR), kalt tAKARα, brukes, som er basert på Förster resonans energi overføring (bånd). Denne genetisk-kodede PKA-sensoren introduseres i motor barken via Utero electroporation (IUE) av DNA-plasmider, eller stereotaxic injeksjon av adeno-assosiert virus (AAV). BÅND endringer er avbildet ved hjelp av to-Foton fluorescens levetid Imaging mikroskopi (2pFLIM), som tilbyr fordeler fremfor ratiometrisk bånd målinger for kvantifisere bånd signal i lys-spredning hjernevev. For å studere PKA aktiviteter under tvungen bevegelse, er tAKARα avbildet gjennom en kronisk skallen vindu over cortex av våken, Head-fast mus, som løper eller hviler på en Speed-kontrollerte motorisert tredemølle. Denne avbildnings tilnærmingen vil være gjeldende for mange andre hjerneregioner for å studere tilsvarende atferds-indusert PKA aktiviteter og til andre FLIM-baserte sensorer for in vivo Imaging.
NeuroModulation, også kjent som langsom Synaptic girkasse, pålegger sterk kontroll over hjernens funksjon under ulike atferds-tilstander, som stress, opphisselse, oppmerksomhet, og bevegelse1,2,3, 4. til tross for sin betydning, studiet av når og hvor neuromodulatoriske hendelser finner sted er fortsatt i sin spede begynnelse. Neuromodulatorer, inkludert acetylkolin, dopamin, noradrenalin, serotonin, og mange nevropeptider, aktivere G protein-sammenkoblede reseptorer (GPCRs), som igjen utløser intracellulære andre Messenger trasé med et bredt vindu av tidsrammer alt fra sekunder til timer. Selv om hver neuromodulator utløser et distinkt sett med signal hendelser, er leiren/proteinet kinase a (pKa) en vanlig nedstrøms vei for mange neuromodulatorer1,5. Leiren/pKa Pathway regulerer neuronal excitability, Synaptic transmisjon, og plastisitet6,7,8,9, og derfor Tunes den neuronal Network Dynamics. Fordi ulike neurons eller neuronal typer uttrykke ulike typer eller nivåer av neuromodulator reseptorer10, den intracellulære effektene av samme ekstracellulære neuromodulator kan være heterogen på tvers av ulike neurons, og dermed må studert med mobilnettet oppløsning. Hittil er det fortsatt utfordrende å overvåke neuromodulatoriske hendelser i individuelle neurons in vivo under atferden.
Å studere spatiotemporal dynamikk av NeuroModulation, en passende innspilling modalitet er nødvendig. Microdialysis og rask skanning syklisk voltammetri er ofte brukt til å studere utgivelsen av neuromodulatorer, men de mangler romlig oppløsning for å overvåke cellulære hendelser11,12. Analoge til kalsium dynamikk blir brukt som en proxy for neuronal elektrisk aktivitet i befolkningen Imaging13, pKa Imaging kan brukes til å lese ut neuromodulatoriske hendelser over en neuronal befolkning på mobilnettet oppløsning. Den foreliggende protokollen beskriver bruken av en forbedret A-kinase aktivitet reporter (AKAR) til å overvåke PKA aktiviteter in vivo under dyr atferd. Metoden som er beskrevet her gir mulighet for samtidig bildebehandling av neuronal populasjoner ved subcellulære oppløsning med en temporal oppløsning som sporer fysiologiske neuromodulatoriske hendelser.
AKARs består av en donor og en Acceptor fluorescerende proteiner forbundet med en pKa fosforylering substrat peptid og en stallgreip-assosiert (FHA) domene som binder seg til fosforylert Serine eller threonin av underlaget14,15. Ved aktivering av PKA veien, underlaget peptid av AKAR er fosforylert. Som følge av FHA domenet binder seg til fosforylert substrat peptid, og dermed bringe de to fluorophores i umiddelbar nærhet, referert til som den lukkede tilstand av AKAR. Den lukkede tilstand av en fosforylert AKAR resulterer i økt Förster resonans energi overføring (bånd) mellom donor og Acceptor fluorophores. Siden andelen fosforylert AKARs er relatert til nivået av pKa aktivitet16, kan mengden av bånd i en biologisk prøve brukes til å kvantifisere nivået av pKa aktivitet16,17,18, 19,20.
Tidlige versjoner av AKARs ble primært utviklet for to-fargers ratiometrisk Imaging14. Når Imaging dypere inn i hjernevevet, lider ratiometrisk metoden fra signal forvrengning på grunn av bølgelengde-avhengig lysspredning17,18,21. Som beskrevet nedenfor, eliminerer fluorescens Lifetime Imaging mikroskopi (FLIM) dette problemet fordi FLIM bare måler fotoner slippes ut av donor fluoroforen18,21. Som et resultat, FLIM kvantifisering av bånd er ikke påvirket av vev-dybde17. I tillegg kan en “mørk” (dvs. lav Quantum yield [QY]) variant av Acceptor fluoroforen brukes. Dette frigjør en fargekanal for å lette multiplekset måling av ortogonale neuronal egenskaper via simultan avbildning av en andre sensor eller en morfologiske markør17,19,20.
FLIM Imaging kvantifiserer tiden som en fluoroforen tilbringer i opphisset tilstand, dvs. den fluorescens levetid18. Avkastningen av en fluoroforen til bakken staten, og dermed slutten av opphisset tilstand, ofte concomitates med utslipp av et foton. Selv om utslipp av et foton for en individuell spent molekyl er Stokastisk, i en befolkning den gjennomsnittlige fluorescens levetid er karakteristisk for den aktuelle fluoroforen. Når en ren befolkning av fluorophores er opphisset samtidig, det resulterer fluorescens ville følge etter etter en enkelt eksponentiell forråtnelse. Tiden konstant av dette eksponentiell forfall tilsvarer gjennomsnittlig fluorescens levetid, som vanligvis spenner fra ett til fire nanosekunder for fluorescerende proteiner. Avkastningen av en spent donor fluoroforen til bakken staten kan også oppstå ved bånd. I nærvær av bånd, fluorescens levetid av donor fluoroforen er redusert. Den unphosphorylated AKARs utstillingen en relativt lengre donor fluorescens levetid. Ved fosforylering av PKA, viser sensoren en kortere levetid fordi donor og Acceptor fluorophores bringes nær hverandre og bånd økes. Kvantifisering av fluorescens levetid i en populasjon av AKARs representerer derfor nivået av PKA aktivitet.
Tidlige versjoner av AKARs har ikke blitt brukt for in vivo Imaging på en enkelt celle oppløsning. Dette skyldes i hovedsak den lave signal amplituden til AKAR-sensorene til fysiologiske aktiveringer17. I den seneste tid, av systematisk sammenlignende anvendelig AKAR sensor for to-Foton fluorescens levetid tenkelig mikroskopi (2pFLIM), en sensor alarmert FLIM-AKAR var grunnlegge å overgå alternativ sensor. Videre ble en rekke FLIM-AKAR-varianter kalt målrettet AKARs (tAKARs) utviklet for å visualisere PKA aktivitet på bestemte subcellulære steder: mikrotubuli (tAKARα), stoffer (tAKARβ), utgangen (tAKARδ), trådformede utgangen (tAKARε), membran (tAKARγ), og postsynaptic tetthet (tAKARζ). Blant tAKARs, tAKARα økt signal amplitude elicited av noradrenalin av 2,7-fold. Dette er i overensstemmelse med kunnskapen om at flertallet av pKa i neurons er forankret til mikrotubuli ved hvile staten22,23. tAKARα var den beste utøver blant eksisterende AKARs for 2pFLIM. Videre oppdaget tAKARα fysiologisk-relevant PKA aktivitet elicited av flere neuromodulatorer, og uttrykk for tAKARα ikke endre neuronal funksjoner17.
Nylig ble tAKARα vellykket brukt til å visualisere PKA aktiviteter i hodet faste oppfører mus17. Det ble vist at tvungen bevegelse utløste PKA aktivitet i Soma av overfladisk lag neurons (lag 1 til 3, opp til en dybde på ~ 300 μm fra Pia) i motoren, fat, og visuelle barken. Den bevegelse-utløste PKA aktiviteten var delvis avhengig signalering via β-adrenerge reseptorer og D1 dopamin-reseptorer, men ble ikke påvirket av en D2 dopamin reseptor motstander. Dette arbeidet illustrerer evnen til tAKARs å spore NeuroModulation hendelser in vivo bruker 2pFLIM.
I den gjeldende protokollen er hele metoden for PKA aktivitet Imaging i hode-fast våken mus under et tvungen bevegelse paradigme beskrevet i seks trinn. Først tillegg av 2pFLIM evner til en konvensjonell to-Foton mikroskop (figur 1). For det andre, byggingen av en motorisert tredemølle (figur 2). For det tredje, uttrykket av tAKARα sensoren i musen cortex av i Utero electroporation (IUE) av DNA plasmider, eller stereotaxic injeksjon av adeno-assosiert virus (AAV). Excellent protokoller for operasjoner for IUE24,25 og stereotaxic injeksjon av viral partikler26 har blitt publisert tidligere. De viktigste parametrene vi brukte er beskrevet nedenfor. Videre installasjon av et skallen vindu. Excellent protokoller har tidligere blitt utgitt for skallen vinduet kirurgi27,28. Flere trinn som er endret fra standardprotokollene, er beskrevet. Femte, opptre i vivo 2pFLIM. Sjette, analysene av 2pFLIM bilder (Figur 3 og Figur 4). Denne tilnærmingen bør være lett tilgjengelig for mange andre hode-faste atferdsmessige paradigmer og hjerneområder.
Denne protokollen demonstrerer bruken av bånd-FLIM sensor tAKARα å visualisere NeuroModulation-utløste PKA aktivitet i hode-fast oppfører mus. Dette programmet er basert på omfattende testing og characterizations av tAKARα in vitro og in vivo for å demonstrere at FLIM signalet innhentet er relevant for fysiologiske neuromodulatoriske hendelser17. Her brukes en in vivo-applikasjon, bevegelse-indusert PKA-aktivitet i motor barken, til å beskrive prosedyrene for å levere sensoren til hjerne…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker MS Tess J. Lameyer, MS Ruth Frank, og Dr. Michael A. Muniak for redigeringer og kommentarer, og Dr. Woojung Yasuda på Max Planck Florida for 2pFLIM oppkjøpet programvare. Dette arbeidet ble støttet av to BRAIN Initiative Awards U01NS094247 (H.Z. og T.M.) og R01NS104944 (H.Z. og T.M.), en R01 Grant R01NS081071 (T.M.), og en R21 Grant R21NS097856 (H.Z.). Alle priser er fra National Institute of nevrologiske lidelser og Stroke, USA.
0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 – 6. Will be provided upon request to the lead author |
Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
Circular coverslip (5mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
Rotation sensor | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
White PE foam roller (8 x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |