Klasse 1 Histon deacetyltransferase (hdacs) som rpda har fået betydning som potentielle mål for behandling af svampeinfektioner. Her præsenterer vi en protokol til den specifikke berigelse af TAP-Tagged RpdA kombineret med en HDAC aktivitet assay, der tillader in vitro effekt testning af Histon histondeacetylase hæmmere.
Klasse 1 histondeacetylaser (HDACs) som RpdA har fået betydning som potentielle mål for behandling af svampeinfektioner og for genomudvinding af svampe sekundære metabolitter. Inhibitor screening kræver dog rensede enzym aktiviteter. Da klasse 1-deacetylaser udøver deres funktion som multiproteinkomplekser, er de normalt ikke aktive, når de udtrykkes som enkelt polypeptider i bakterier. Derfor, endogene komplekser skal isoleres, som, når konventionelle teknikker som ion udveksling og størrelse udelukkelse kromatografi anvendes, er besværlig og tidskrævende. Tandem affinitet rensning er blevet udviklet som et værktøj til at berige multi protein komplekser fra celler og dermed viste sig at være ideel til isolering af endogene enzymer. Her giver vi en detaljeret protokol for enkelt-trins berigelse af aktive RpdA komplekser via det første rensningstrin af C-terminally TAP-Tagged RpdA fra Aspergillus nidulans. De oprensede komplekser kan derefter anvendes til den efterfølgende inhibitor screening, der anvender en histondeacetylase-analyse. Protein berigelsen sammen med den enzymatiske aktivitetsanalyse kan gennemføres inden for to dage.
Histone deacetylaser (HDACs) er Zn2 +-afhængige hydrolytiske enzymer, der kan fjerne acetylgrupper fra lysinrester af histoner og andre proteiner. På baggrund af sekvens ligheden grupperes HDACs i flere klasser1. For nylig, svampe klasse 1 HDAC RpdA, en ortholog af bageri gær (Saccharomyces cerevisiae) Rpd3p, viste sig at være afgørende for den opportunistiske svampe patogen Aspergillus fumigatus2. Derfor har RpdA fået betydning som et potentielt mål for behandling af svampeinfektioner2. Vurdering af histondeacetylase aktivitet in vitro er vigtig for karakterisering af enzymatiske egenskaber og gør det muligt at bestemme effekten af nye stoffer til inhibitor udvikling. Selv om rekombinant udtryk for en codon-optimeret version af human HDAC1 i Escherichia coli er blevet rapporteret for nylig3, forsøg på at udtrykke fuld længde rpda i denne vært mislykkedes4. Da svampe klasse 1-HDACs såsom RpdA og HosA udøver deres funktion som multiproteinkomplekser, er det desuden gunstigt at anvende indfødte endogene komplekser til forsøg med enzymatiske inhibitorer. På grund af hæmmende faktorer og tilstedeværelsen af forskellige HDAC’er i svampe lysater er katalytisk aktivitet målt i hele protein ekstrakter imidlertid relativt lav og kan ikke henføres til individuelle enzymer. Desuden identificerede tidligere undersøgelser i filamentøse svamp a. nidulans en klasse 2 HDAC, hdaa, som fremherskende histondeacetylase i kromatografiske fraktioner af svampe ekstrakter. Der er således behov for flere konventionelle kromatografiske rensningstrin for at adskille ikke-HdaA-aktivitet fra svampe stammer4. Introduktionen af en TAP-strategi (tandem Affinity oprensning) i A. nidulans5 har mindsket berigelsen af specifikke histondeacetylase-aktiviteter betydeligt. Det oprindelige TAP-tag består af to protein A-domæner og et calmodulinbindende peptid (CBP) adskilt af en tobak etch virus proteasehæmmere (TEV) spaltnings sted6. Dette giver mulighed for native rensning og eluering af mærkede proteiner, herunder deres interaktions partnere7. Ved brug af de berigede proteiner til aktivitets analyser er den milde eluering under de oprindelige forhold ved proteasespaltning et vigtigt træk ved rensning af TAP-tag. Et GFP-mærket protein, for eksempel, kan beriges ved immobiliserede antistoffer samt, dog, kan ikke elueres under indfødte forhold.
Her giver vi en detaljeret protokol for enkelt-trins berigelse af aktive RpdA komplekser via det første rensningstrin af C-terminally TAP-Tagged RpdA fra a. nidulans (IgG separation og TEV spaltning) til efterfølgende inhibitor screening, der anvender en Histon-histondeacetylase-assay. Som vist sig at være tilstrækkelig, affinitet berigelse var begrænset til blot et rensningstrin også fordi den enzymatiske aktivitet blev signifikant reduceret efter to-trins TAP rensning sammenlignet med IgG rensning alene.
Ikke desto mindre bør den indførte protokol også gælde for tilsætning af andre mærkede enzymer, der er involveret i kromatin regulering såsom acetyltransferaser, methyltransferaser og demethylaser. Ved at tilføje det andet rensningstrin i TAP-protokollen kan proteiner, der er co-renset med de kodede lokkemad, betragtes som komplekse partnere af (nye) enzymatiske komplekser.
Denne protokol beskriver en enkelt trins berigelse af en Tap-Tagged klasse 1 HDAC fra filamentøse svamp a. nidulans til vurdering af in vitro histondeacetylase aktivitet. TAP-mærket blev oprindeligt introduceret i bageri gær til identifikation af protein-protein interaktion partnere af det mærkede protein6. Efterfølgende blev tagget codon-optimeret til brug i A. nidulans5. Her giver vi en ligetil trin-for-trin protokol til anvendelse af det første affinitet rensningstrin i TAP strategi for enkelt-trins berigelse af klasse 1 HDAC RpdA. Det andet affinitet rensningstrin øger klart rensningsniveauet, hvilket er særlig vigtigt for identifikationen af agn-interagerende proteiner. Ikke desto mindre anbefales kun det første trin til efterfølgende aktivitets test, da manglen på signifikant kontaminering efter det første trin blev bekræftet af et kontrolforsøg med en vildtype stamme. Desuden er elueret aktivitet betydeligt højere efter enkelt trin berigelse sammenlignet med den fulde TAP. Ud over RpdA2, blev denne protokol også med held brugt til at rense A. nidulans komplekser af anden klasse 1 HDAC hosa21.
På grund af vores observationer, at svampe klasse 1 HDACs opbygge stabile komplekser4, er det lykkedes os at ændre protokollen ved Bayram et al. 201212 , der repræsenterer grundlaget for denne metode. Ikke desto mindre skal der nævnes nogle kritiske skridt. Fremstilling af stærkt koncentrerede protein ekstrakter for at sikre nær-fysiologiske forhold er afgørende for kompleks stabilitet. Derfor er det vigtigt at tænke på de givne anbefalinger vedrørende biomasse/udvinding buffer ratio. I denne henseende, det er også afgørende at bruge godt jorden fine mycelial pulvere for at sikre korrekt udvinding. Her er brugen af en slibemaskine klart fordelagtig. Som nævnt i protokollen afsnit, er det værd at prøve TEV-Cleavage trin for 1-2 h ved stuetemperatur for at fremskynde rensningen. Dette blev testet for RpdA uden at observere nogen skadelige virkninger på stabiliteten (ikke offentliggjorte observation, Bauer I, 2018). Desuden er udskiftning af NP40 (anvendes i den oprindelige protokol) med TX-100 måske ikke egnet til andre protein komplekser. Når du bruger denne metode til rensning af andre TAP-mærkede proteiner, bør man også henvise til Bayram-protokollen, som indeholder en rækkeværdi fulde hints, der kan være nyttige for en tilstrækkelig rensning af andre protein komplekser12.
Ud over de her beskrevne Tap-metode, andre affinitet Tags og teknikker er almindeligt anvendt til enkelt-trins berigelse af protein af filamentøse svampe, herunder hans-og gfp-Tags. Da klasse 1 HDACs generelt er funktionelle som højmolekylære komplekser, er Native elutions betingelser imidlertid en forudsætning for berigelse af katalytisk aktive HDACs. Vigtigere, mange andre affinitet purifikationer udføres under ugunstige forhold. For eksempel er tilsætning af HDACs via GFP-Trap, som er baseret på antigen-antistof-interaktion, ikke egnet på grund af de sure elueringsforhold, der forstyrrer protein-protein interaktionen mellem HDAC-komplekser, der er bundet til harpiks. Desuden medførte forsøg på at rense hans-mærkede RpdA med metalchelataffinitet kromatografi22, et betydeligt tab af katalytisk aktivitet under rensningsproceduren, selv om imidazol i stedet for lav-ph-betingelser blev anvendt til eluering ( ikke-offentliggjorte data, Bauer, I, 2010).
En begrænsning af den beskrevne enzymatiske assay-protokol er brugen af det radioaktive substrat. Men, analyser på et fluorescerende grundlag er blevet udviklet så godt23,24 og er kommercielt tilgængelige. Disse analyser udføres i brønd plader og er derfor også velegnede til screening af HDAC-hæmmere med høj dataoverførselshastighed. I så fald ville en opskalere af den præsenterede procedure være påkrævet.
Potentielle kommende anvendelser af denne protokol omfatter berigelse af specifikke sub-komplekser af klasse 1 HDACs til at vurdere deres specifikke fysiologiske roller og/eller forskelle i deres følsomhed over for HDAC-hæmmere. Ved fastlæggelsen af den beskrevne metode for andre enzymer anbefales det kraftigt at udføre et negativt kontrol eksperiment med en ukodet stamme. Dette sikrer specificitet af målte enzym aktiviteter og afslører kontaminering med ikke specifikt bundne enzymer.
Rensnings-og aktivitets analysen, der beskrives her, kan udføres inden for to dage, og de berigede enzymer er stabile i mindst flere måneder, når de opbevares i aliquoter ved-80 °C. Afslutningsvis, denne protokol giver en forholdsvis enkel og omkostningseffektivmåde at opnå klasse 1 HDAC komplekser til aktivitet måling og bestemmelse af inhibitor virkning.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Petra Merschak, afdelingen for molekylær biologi (Biocenter, Medical University of Innsbruck), for hendes hjælp og støtte til dette manuskript. Derudover vil vi gerne takke korrekturlæserne for deres værdifulde kommentarer.
Dette arbejde blev finansieret af den østrigske videnskabs fond (P24803 til SG og P21087 til GB) og af murene finansiering (MUI start, ST201405031 til Ib).
10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
Acetic acid | Roth | 7332 | |
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
Cell strainer | Greiner | 542040 | |
Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
Glycerol | Roth | 3783 | |
HCl | Roth | 4625 | |
IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
KOH | Merck | 5033 | |
Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
NaCl | Roth | 3957 | |
NaOH | Roth | 6771 | |
Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
Tris (free base) | Serva | 37190 | |
Tris-HCl | Roth | 9090 | |
Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |