Ex Vivo expansión de células madre hematopoyéticas de cordón Umbilical humano derivadas de sangre CD34+ las células usando el ácido valproico
Summary
Aquí, describimos la ex vivo expansión de células madre hematopoyéticas de CD34+ en células de sangre de cordón umbilical trataron con una combinación de un cytokine cóctel y VPA. Este método conduce a un grado significativo de ex vivo expansión de HSCs primitivo ya sea clínica o aplicaciones de laboratorio.
Abstract
Unidades de cordón umbilical sangre (UCB) proporcionan una fuente alternativa de humanos las células madre hematopoyéticas (HSCs) para pacientes que requieren trasplante de médula ósea alogénica. Mientras que la UCB tiene varias ventajas únicas, un número limitado de HSCs dentro de cada unidad UCB limita su uso en medicina regenerativa y el trasplante de HSC en adultos. Expansión eficiente de HSCs humanas funcionales puede lograrse ex vivo cultivo de CD34+ de las células aisladas de UCBs y tratados con un inhibidor de la deacetilasa, ácido valproico (VPA). El protocolo detallado aquí describe la metodología para aislar rápidamente a CD34 y condiciones de cultivo+ células y ampliar a un alto grado un grupo de primitivos HSCs. Las HSCs ampliadas son capaces de establecer engraftment tanto a corto como a largo plazo y son capaces de dar lugar a todos los tipos de células hematopoyéticas diferenciadas. Este método también tiene potencial para el uso clínico en terapia del gene de autólogo HSC y ofrece un enfoque atractivo para superar la pérdida de HSCs funcionales asociados con la edición de genes.
Introduction
Ex vivo expansión de células madre hematopoyéticas (HSCs) de sangre de cordón umbilical unidades (UCB) es muy prometedor para aplicaciones de HSC en medicina regenerativa y terapia de trasplante. Trasplante con unidades de la UCB tiene varias ventajas únicas como colección easy, alta disponibilidad, mínimo riesgo de infección, bajo riesgo de recaída de la enfermedad y la baja frecuencia de injerto contra enfermedad del anfitrión (GVHD). Sin embargo, las principales desventajas de su uso en contextos clínicos son el limitado número de HSCs presentes dentro de cada unidad UCB1. El número insuficiente de HSCs resultados en retardada injerto y recuperación hematopoyética, riesgo de rechazo al injerto y reconstitución inmune aberrante.
En la actualidad, ha desarrollado diversos métodos y estrategias ex vivo ampliar el limitado número de HSCs de UCBs. Combinaciones de citoquinas diferentes cócteles con pequeñas moléculas o compuestos en ex vivo culturas dan como resultado diferentes grados de expansión en HSC números2,3,4,5,6, 7,8. Lo importante es ex vivo cultura condiciones inducen estrés, llevando a la proliferación celular rápida, aumento de la actividad metabólico y pérdida de las características primitivas que definen HSCs primarias. Por lo tanto, están necesario desarrollar protocolos que conducen a la expansión de un gran número de HSCs funcionales con características que asemejan HSCs primitivo primarias.
Cultivos libres de suero de CD34+ las células aisladas de UCBs y tratamiento con valproico ácido (VPA) dan como resultado la expansión de un gran número de primitivos HSCs4,9,10. La expansión de HSC no es únicamente debido a la proliferación de las HSCs existentes derivados de UCBs. En cambio, esta expansión es debido a la adquisición de un fenotipo primitivo combinado con un número limitado de divisiones celulares y proliferación9. Dentro de la inicial 24-48 h de incubación con una combinación de citocinas y VPA, CD34+ células adquieren un perfil fenotípico que caracterizan a las HSCs a largo plazo y transcriptómicos. El aumento significativo en el porcentaje de HSCs es acompañado por un aumento rápido del número de HSCs (63 veces aumento dentro de las 24 h de tratamiento de VPA)9. En particular, la estrategia de expansión de VPA-ex vivo expande HSCs con baja actividad metabólica, que resalta aún más sus características primitivas.
El método aquí descrito ofrece condiciones y tratamientos que conducen a un grado significativo de ex vivo expansión de HSCs primitivo ya sea clínica o aplicaciones de laboratorio. Este ex vivo estrategia de expansión utiliza un cóctel de cytokine combinado con el tratamiento de VPA. VPA es un fármaco aprobado por la FDA para el tratamiento de trastornos bipolares y otras enfermedades neurológicas. La expansión de HSC con VPA es rápida y ocurre dentro de 7 días, minimizando el tiempo de manipulación y el riesgo de contaminación. Lo importante, este protocolo permite la adquisición de los marcadores fenotípicos a largo plazo de HSC como CD90 y CD49f dentro de las 24-48 h después del tratamiento con VPA9. Injertos HSC ampliados con este protocolo tienen la capacidad de regenerar el sistema hematopoyético, puesto que pueden diferenciarse en todos los linajes de células hematopoyéticas y establecer a largo plazo injerto tras trasplante en los ratones del grupo de myeloablated modelos4. Por otra parte, este protocolo es altamente reproducible y permite un aislamiento eficiente y rápido de CD34 viable+ células de UCBs, que es fundamental para la industrialización de este procedimiento.
La APV ex vivo protocolo de expansión también tiene el potencial para superar la pérdida significativa de HSCs que ocurre durante la edición11del gene. Gen de edición requiere exposición a citoquinas, que son necesarios para ciclismo las células y la activación de mecanismos de reparación del ADN. Debido a la rápida de tratamiento de VPA, este método podría ser beneficioso para la generación de un mayor número de células genéticamente modificadas en un período de tiempo que es relevante para la actualidad utiliza protocolos de modificación génica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adjunto, presentamos un protocolo para ampliar rápidamente a un grado significativo el número de HSCs humanos funcionales de UCBs. Los estudios piloto y cinéticos utilizando este protocolo indican que el ex vivo ampliado las células rápidamente adquirir y conservar la expresión de varios marcadores fenotípicos de HSC como CD90 primitivo HSC características metabólicas9.
Ex vivo protocolo de expansión es relativamente simple y confiable. Purificación de CD34 c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NYSTEM conceder C030136 a der. Nos gustaría dar las gracias Bartek Jablonski para su retroalimentación y revisión del manuscrito
Materials
| Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
| AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
| APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BD Falcon 15 ml Tube | BD Biosciences | 352097 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
| Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
| Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
| Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
| Inverted microscope | |||
| PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
| Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
| Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
| Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
| Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |
References
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