في فيفو الحقن المجسمة داخل الدماغ لتحفيز البصريات من المدخلات بعيدة المدى في شرائح الدماغ الماوس
Summary
يصف هذا البروتوكول مجموعة من الطرق لتحديد الاتصال الوظيفي الخاص من نوع الخلية من المدخلات طويلة المدى من مناطق الدماغ البعيدة باستخدام التحفيز البصري في شرائح الدماغ في الجسم الحي السابق.
Abstract
معرفة من نوع الخلية اتصال متشابك محددة هو شرط مسبق حاسم لفهم الدوائر العصبية على نطاق الدماغ. التحقيق الوظيفي للاتصالات طويلة المدى يتطلب تسجيلات مستهدفة من الخلايا العصبية واحدة جنبا إلى جنب مع التحفيز المحدد للمدخلات البعيدة المحددة. وغالبا ً ما يكون من الصعب تحقيق ذلك باستخدام تقنيات التحفيز التقليدية والكهربائية، لأن المحاور من مناطق الدماغ المتقاربة في المنبع قد تختلط في المنطقة المستهدفة. ويتيح استهداف منطقة دماغية محددة لتعبير قنوات أيون حساسة للضوء بتسمع مجسم ة من قبل الفيروس التحفيز الانتقائي للمحاور الناشئة من تلك المنطقة بالضوء. يمكن استخدام الحقن المجسمة داخل الدماغ في هياكل محددة جيدا، مثل النوى الثالية الأمامية، بالإضافة إلى المناطق الأخرى تحت القشرية أو القشرية في جميع أنحاء الدماغ.
وصف هنا هو مجموعة من التقنيات لحقن مجسمة دقيقة من ناقلات الفيروسية التي تعبر عن channelrhodopsin في الدماغ الماوس، تليها التحفيز الضوئي للمحطات axon في إعداد شريحة الدماغ. وهذه البروتوكولات بسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع. في تركيبة مع كامل الخلية التصحيح تسجيل المشبك من الخلايا العصبية المتصلة postsynaptically، والتحفيز الضوئي للمحاور يسمح الكشف عن الاتصالات متشابك وظيفية، والتوصيف الدوائي، وتقييم قوتها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام ملء السيتين من الخلايا العصبية المسجلة لتحديد مورفولوجيما ما بعد مخصص للخلية العصبية postynaptic.
Introduction
تعريف الاتصال بين مناطق الدماغ ضروري لفهم الدوائر العصبية. تسمح أساليب التتبع التشريحي الكلاسيكية بإنشاء اتصال أقاليمي، وتساعد دراسات الآفات على فهم التنظيم الهرمي لتدفق المعلومات. على سبيل المثال، دوائر الدماغ للاتجاه المكاني واتجاه الرأس الإشارات تنطوي على تدفق الاتجاه من المعلومات من المهاد إلى presubiculum. وقد ثبت هذا من خلال دراسات الآفات من النوى الثالية الصدغية الصدغية (ADN) التي تتحلل إشارة اتجاه الرأس في presubiculum الظهرية المصب، فضلا عن إشارة خلية الشبكة parahippocampal1،2.
الاتصال الوظيفي بين مناطق الدماغ هو أكثر صعوبة في إنشاء على مستوى الخلوية ودون الخلوية. في الحصين، يسمح التشريح المنظم للغاية بالتحقيق في اتصالات متشابكة خاصة بالمسار باستخدام المحاكاة الكهربائية في إعداد الشريحة. يمكن استخدام أقطاب التحفيز الموضوعة في طبقة الراديوتوم من CA1 لتحفيز المدخلات الجانبية شافر على وجه التحديد من CA33. تحفيز الأقطاب الكهربائية وضعت في الطبقة lacunosum الجزيئية من CA1 سوف تنشيط مدخلات مسار مثقب إلى CA14،5. التحفيز الكهربائي ينشط الإفراج العصبي من محطات axon; ومع ذلك، فإنه ينشط الخلايا العصبية مع سوماتا بالقرب من موقع التحفيز، فضلا عن محاور المرور. ولذلك فهي ذات استخدام محدود لدراسة الأوفيرينتس من مناطق الدماغ المحددة عندما تختلط الألياف من مناطق منشأ مختلفة في الهيكل المستهدف، كما هو الحال عادة في القشرة الجديدة.
ويمكن أيضا تحفيز الخلايا العصبية مع الضوء. وتشمل الطرق البصرية التنشيط الضوئي للغلوتامات القفص، والتي يمكن الجمع بينها وبين واحد أو اثنين من المسح الضوئي بالليزر الفوتون. يمكن تحفيز مواقع متعددة متباعدة بشكل وثيق بالتتابع، مع عدم وجود ضرر ميكانيكي للأنسجة6. وقد استخدم هذا بنجاح لرسم خريطة مستقبلات متشابك وكذلك تنشيط الخلايا العصبية الفردية7. في حين يمكن استخدام الغلوتامات في تحليل الدوائر المحلية، فإنه لا يسمح لتنشيط محددة من المدخلات طويلة المدى.
طريقة الاختيار للتحقيق في الاتصال بعيد المدى في الدوائر العصبية هو استخدام التعبير channelrhodopsin بوساطة الفيروس. باستخدام الحقن المجسمة في الجسم الحي كما هو موضح هنا، يمكن استهداف التعبير عن قنوات أيون ذات بوابات خفيفة ويقتصر مكانيا على منطقة الدماغ المطلوبة. وبهذه الطريقة، تكون القنوات فعالة لرسم خرائط الاتصال المحفز أو المثبط من منطقة إلى هدفها. يمكن تحفيز محطات المحاور المتحولة مع الضوء في إعداد شريحة الدماغ، وتسجيلات التصحيح المشبك كقراءة تسمح بفحص وظائف ونقاط القوة من مكونات دائرة محددة في الدماغ8. النهج البصري جنبا إلى جنب مع حقن مجسمة من الفيروس يقدم خصوصية غير مسبوقة والسيطرة الوراثية9. تحفيز مع الضوء بالإضافة إلى ذلك يسمح لكل من الدقة الزمنية والمكانية العالية10،11.
وpresubiculum هو هيكل القشرية من ست طبقات في الانتقال من الحصين وتشكيل شبه فرس النهر12،13. هو يستلم مساهمة مهمّة متشابكة من ال [أدن]11 غير أنّ أيضا من عدّة أخرى [كورتك] ومناطق تحتالقشريّة 14. وهكذا، فإن التحفيز الانتقائي لمحطات المحاور الثلاميك داخل شريحة ما قبل الخضوع غير ممكن مع التحفيز الكهربائي ولا الغلوتامات المنقطع. الموصوفة في هذا البروتوكول هي طرق لتحديد الاتصال الوظيفي بين مناطق الدماغ (ADN وpresubiculum) باستخدام حقن مجسمة دقيقة من النواقل الفيروسية التي تعبر عن قنوات ذات بوابات خفيفة. كما وصف هو التحفيز الضوئي للمحطات axons من إسقاط الخلايا العصبية في منطقتهم المستهدفة، إلى جانب تسجيلات التصحيح المشبك الخلية الكاملة من الخلايا العصبية ما بعد متشابك في إعداد شريحة الدماغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الحقن الفيروسي في الجسم الحي للتعبير عن أوبسينات حساسة للضوء في منطقة الدماغ المحددة هو طريقة الاختيار للتحليل البصري للاتصال الوظيفي طويل المدى10،11،17،18. حقن مجسمة توفر إمكانية لاستهداف منطقة محددة من الدماغ على وج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر برتراند ماثون، ميري نصار، لي وين هوانغ، وجان سيمونيت على مساعدتهم في تطوير الإصدارات السابقة من بروتوكول حقن المجسمة ومارين مانويل وباتريس جيغوزو للمساعدة التقنية. وقد دعمت هذا العمل وزارة التعليم والبحث الفرنسية (L.R., L.S.), Centre National des Etudes Spatiales (M.B.), and Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D.F.).
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Huang, L. -. W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
