In vivo intracerebral Stereotaxiske injektioner til Optogenetisk stimulering af langtrækkende indgange i musehjerne skiver
Summary
Denne protokol beskriver et sæt af metoder til at identificere celle typen specifik funktionel konnektivitet af langtrækkende input fra fjerntliggende hjerneområder ved hjælp af optogenetiske stimuleringer i ex vivo hjerne skiver.
Abstract
Viden om celle-typespecifikke synaptiske tilslutningsmuligheder er en afgørende forudsætning for at forstå hjernen-dækkende neuronal kredsløb. Den funktionelle undersøgelse af langtrækkende forbindelser kræver målrettede optagelser af enkelt neuroner kombineret med den specifikke stimulering af identificerede fjerne indgange. Dette er ofte vanskeligt at opnå med konventionel og elektrisk stimulation teknikker, fordi axoner fra konvergerende opstrøms hjerneområder kan blande sig i målregionen. Den stereotaxiske målretning af en specifik hjerneregion for virus medieret ekspression af lysfølsomme Ionkanaler muliggør selektiv stimulering af axoner, der kommer fra denne region med lys. Intracerebral stereotaxiske injektioner kan anvendes i veldefinerede strukturer, såsom den forreste thalamic kerner, foruden andre subkortikale eller kortikale områder i hele hjernen.
Beskrevet her er et sæt af teknikker til præcis stereotaxisk injektion af virale vektorer udtrykker channelrhodopsin i muse hjernen, efterfulgt af foto stimulation af Axon terminaler i hjernen skive forberedelse. Disse protokoller er enkle og almindeligt anvendelige. I kombination med hel-celle patch clamp optagelse fra en postsynaptisk forbundet Neuron, foto stimulation af axoner tillader påvisning af funktionelle synaptiske forbindelser, farmakologisk karakterisering, og evaluering af deres styrke. Desuden kan biocytinel fyldning af den indspillede neuron anvendes til post-hoc morfologiske identifikation af den postsynaptiske neuron.
Introduction
Det er nødvendigt at definere konnektivitet mellem hjerneregioner for at forstå neurale kredsløb. Klassiske anatomiske sporingsmetoder gør det muligt at etablere interregionale tilslutningsmuligheder, og læsions undersøgelser er med til at forstå den hierarkiske organisering af informationsstrømmen. For eksempel, hjerne kredsløb for rumlig orientering og hovedretning signalering involverer den retningsbestemte strøm af oplysninger fra thalamus til formodbiculum. Dette er blevet påvist ved læsions studier af Antero-dorsale thalamic kerner (ADN), der nedbryder hovedretningen signal i nedstrøms dorsale formodbiculum, samt parahippocampale gittercelle signal1,2.
Den funktionelle konnektivitet mellem hjerneområder er vanskeligere at etablere på et cellulært og subcellulært niveau. I hippocampus, en meget organiseret anatomi gør det muligt at undersøge pathway-specifikke synaptiske forbindelser ved hjælp af elektrisk simulering i Skive forberedelse. Stimulerings elektroder placeret i Stratum radiatum af Carnot kan bruges til specifikt at stimulere Schaffer-sikkerhedsstillelse fra3. Stimulering af elektroder placeret i Stratum lacunosum moleulare af Carnot vil aktivere stien Path-indgangen til4,5. Elektrisk stimulation aktiverer neurotransmitter frigivelse fra Axon terminaler; men det aktiverer neuroner med somata nær stimulerings stedet samt axoner passage. Det er derfor af begrænset brug for at studere afferenter fra definerede hjerneområder, når fibre af forskellige regioner i oprindelse blander sig i målstrukturen, som det typisk er tilfældet i neocortex.
Neuroner kan også stimuleres med lys. Optiske metoder omfatter fotoaktivering af bur glutamat, som kan kombineres med en-eller to-foton Laserscanning. Flere tæt fordelt steder kan stimuleres sekventielt, uden mekaniske skader på vævet6. Dette er blevet brugt med succes til at kort synaptisk receptorer samt aktivere individuelle neuroner7. Mens glutamat-uncaging kan bruges til lokal kredsløbsanalyse, giver det ikke mulighed for specifik aktivering af langtrækkende indgange.
En metode til valg til undersøgelse af langtrækkende konnektivitet i neuronal kredsløb er brugen af virus-medieret channelrhodopsin udtryk. Brug in vivo stereotaxiske injektioner som beskrevet her, kan ekspression af lys-gated ion kanaler målrettes og rumligt begrænses til en ønsket hjerneregion. På denne måde, channelrhodopsins er effektive til kortlægning excitatoriske eller hæmmende tilslutningsmuligheder fra en region til sit mål. Transfected axoner terminaler kan stimuleres med lys i en hjerne skive forberedelse, og patch-klemme optagelser som en læse-out tillade undersøgelse af de funktioner og styrker af specifikke kredsløb komponenter i hjernen8. Den optogenetiske tilgang kombineret med stereotaxisk injektion af en virus giver enestående specificitet og genetisk kontrol9. Stimulering med lys giver desuden mulighed for både høj tidsmæssig og rumlig præcision10,11.
Den formodbiculum er en seks-lags kortikale struktur ved overgangen af hippocampus og para-hippocampale dannelse12,13. Det modtager vigtige synaptiske input fra ADN11 , men også fra flere andre kortikale og subkortikale regioner14. Således er selektiv stimulering af thalamic axoner terminaler inden for en formodnings skive ikke mulig med elektrisk stimulation eller glutamat-ondning. Beskrevet i denne protokol er metoder til at bestemme funktionelle forbindelser mellem hjernen regioner (ADN og formodbiculum) ved hjælp af præcise stereotaksisk injektioner af virale vektorer udtrykker lys-gated kanaler. Også beskrevet er foto stimulation af axoner terminaler af projicerende neuroner i deres målregion, kombineret med hele cellen patch-clamp optagelser af post-Synaptic neuroner i hjernen skive forberedelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo viral injektion til at udtrykke lysfølsomme opsynder i et defineret hjerne område er en valgmetode til optogenetiske analyse af langtrækkende funktionelle tilslutningsmuligheder10,11,17,18. Stereotaxiske injektioner giver mulighed for præcist at målrette et bestemt område af hjernen. Coexpression af en opsin med en fluorescerende reporter bekvemt gør det muligt at evaluere den ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Bertrand Mathon, mérie Nassar, Li-Wen Huang, og Jean simonnet for deres hjælp i udviklingen af tidligere versioner af stereotaksisk Injection Protocol og Marin manuel og Patrice Jegouzo for teknisk hjælp. Dette arbejde blev støttet af det franske ministerium for uddannelse og forskning (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.) og Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Huang, L. -. W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
