In vivo intracerebrale Stereotaxic injecties voor Optogenetische stimulatie van lange-afstand ingangen in muis hersenen segmenten
Summary
Dit protocol beschrijft een reeks methoden voor het identificeren van de cel-type specifieke functionele connectiviteit van lange-bereik ingangen van verre hersengebieden met behulp van optogenetische stimulaties in ex vivo hersenen segmenten.
Abstract
Kennis van cel-type specifieke synaptische connectiviteit is een cruciale voorwaarde voor het begrijpen van de hersenen-brede neuronale circuits. Het functionele onderzoek van lange-afstands verbindingen vereist gerichte opnames van enkelvoudige neuronen gecombineerd met de specifieke stimulatie van geïdentificeerde verre ingangen. Dit is vaak moeilijk te bereiken met conventionele en elektrische stimulatie technieken, omdat axonen van het convergeren van upstream hersengebieden kunnen intermengen in de doelregio. De stereotaxic targeting van een specifiek hersengebied voor de virus gemedieerde expressie van lichtgevoelige ionenkanalen maakt selectieve stimulatie mogelijk van axonen afkomstig uit die regio met licht. Intracerebrale stereotaxic injecties kunnen worden gebruikt in goed afgebakende structuren, zoals de anterieure thalamische kernen, naast andere subcorticale of corticale gebieden in de hersenen.
Hier beschreven is een reeks technieken voor precieze stereotaxic injectie van virale vectoren die channelrhodopsin uitdrukken in de muis hersenen, gevolgd door foto stimulatie van Axon terminals in de voorbereiding van de hersen slice. Deze protocollen zijn eenvoudig en breed toepasbaar. In combinatie met whole-Cell Patch clamp opname van een postsynaptisch verbonden neuron, maakt foto stimulatie van axonen het mogelijk om functionele synaptische verbindingen, farmacologische karakterisering en evaluatie van hun kracht te detecteren. Bovendien kan biocytine vulling van het opgenomen neuron worden gebruikt voor post-hoc morfologische identificatie van het postsynaptische neuron.
Introduction
Definiëren van connectiviteit tussen hersen regio’s is nodig om te begrijpen van neurale circuits. Klassieke anatomische traceer methoden maken het mogelijk om interregionale connectiviteit te creëren, en laesie studies helpen om de hiërarchische organisatie van informatiestromen te begrijpen. Bijvoorbeeld, hersencircuits voor ruimtelijke oriëntatie en hoofdrichting signalering betrekken de directionele stroom van informatie van de thalamus naar de presubiculum. Dit is aangetoond door laesie studies van Antero-dorsale thalame kernen (ADN) die het hoofd richtings signaal in de downstream dorsale presubiculum degraderen, evenals de parahippocampal grid Cell Signal1,2.
De functionele connectiviteit tussen hersengebieden is moeilijker vast te stellen op een cellulair en subcellulair niveau. In de Hippocampus maakt een zeer georganiseerde anatomie het mogelijk om pathway-specifieke synaptische verbindingen te onderzoeken met behulp van elektrische simulatie in de segment voorbereiding. Stimulatie elektroden geplaatst in stratum radiatum van CA1 kunnen worden gebruikt om specifiek Schaffer onderpand input van CA33te stimuleren. Stimulerende elektroden geplaatst in stratum lacunosum moleculare van Ca1 zal de perforant pad ingang naar Ca14,5activeren. Elektrische stimulatie activeert de neurotransmitter-afgifte van Axon-terminals; echter, het activeert neuronen met somata in de buurt van de stimulatie plaats, evenals axonen van passage. Het is daarom van beperkte toepassing voor het bestuderen van afferents uit afgebakende hersengebieden wanneer vezels van verschillende regio’s van oorsprong elkaar mengen in de doel structuur, zoals meestal het geval is in de neocortex.
Neuronen kunnen ook worden gestimuleerd met licht. Optische methoden omvatten de fotoactivering van gekooide glutamaat, die kan worden gecombineerd met een-of twee-Photon Laser Scanning. Meerdere dicht verdeelde plaatsen kunnen opeenvolgend worden gestimuleerd, zonder mechanische beschadiging van het weefsel6. Dit is met succes gebruikt voor het toewijzen van synaptische receptoren evenals activeren individuele neuronen7. Terwijl glutamaat uncaging kan worden gebruikt voor lokale circuit analyse, het is niet toegestaan voor specifieke activering van lange-bereik ingangen.
Een methode van keuze voor het onderzoek van lange afstand connectiviteit in neuronale circuits is het gebruik van virus-gemedieerde channelrhodopsin expressie. Met behulp van in vivo stereotaxic injecties zoals hier beschreven, de uitdrukking van licht-gated ionenkanalen kunnen worden gericht en ruimtelijk beperkt tot een gewenste hersenregio. Op deze manier, channelrhodopsins zijn effectief voor het in kaart brengen van excitatory of remmende connectiviteit van de ene regio naar het doelwit. Getransfeerde axonen terminals kunnen met licht worden gestimuleerd in een hersen segment voorbereiding, en patch-klem opnames als een read-out laten onderzoek toe van de functies en sterktes van specifieke circuit componenten in de hersenen8. De optogenetische benadering gecombineerd met stereotaxic injectie van een virus biedt ongekende specificiteit en genetische controle9. Stimulerend met licht zorgt bovendien voor zowel hoge temporele als ruimtelijke precisie10,11.
De presubiculum is een corticale structuur van zes lagen bij de overgang van de hippocampus en de para-hippocampal formatie12,13. Het ontvangt belangrijke synaptische input van het ADN11 maar ook uit verschillende andere corticale en subcorticale regio’s14. Zo is de selectieve stimulatie van thalame axonen terminals binnen een presubicular slice niet mogelijk met elektrische stimulatie of glutamaat uncaging. Beschreven in dit protocol zijn methoden om te bepalen van de functionele connectiviteit tussen hersengebieden (ADN en presubiculum) met behulp van precieze stereotaxic injecties van virale vectoren uitdrukken van licht-gated kanalen. Ook beschreven is de foto stimulatie van axonen terminals van het projecteren van neuronen in hun doelregio, in combinatie met whole-Cell Patch-clamp opnames van post synaptische neuronen in de hersenen slice voorbereiding.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo virale injectie om lichtgevoelige opsins in een gedefinieerd hersengebied te uiten, is een keuze methode voor de optogenetische analyse van functionele connectiviteit met lange afstand10,11,17,18. Stereotaxic injecties bieden de mogelijkheid om precies te richten op een specifiek gebied van de hersenen. De coexpressie van een opsin met een fluorescerende reporter maakt een gunstige eval…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang en Jean Simonnet voor hun hulp bij de ontwikkeling van eerdere versies van het stereotaxic Injection protocol en Marin Manuel en Patrice Jegouzo voor technische hulp. Dit werk werd gesteund door het Franse Ministerie van onderwijs en onderzoek (L. R., L. S.), Centre National des Etudes spatiales (M. B.), en Agence nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Huang, L. -. W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
