Injections stéréotaxiques intracérébrales in vivo pour la stimulation optogénétique des entrées à longue portée dans les tranches de cerveau de souris
Summary
Ce protocole décrit un ensemble de méthodes pour identifier la connectivité fonctionnelle spécifique de type cellulaire des entrées à longue portée des régions éloignées de cerveau utilisant des stimulations optogénétiques dans des tranches de cerveau ex vivo.
Abstract
La connaissance de la connectivité synaptique spécifique de type cellulaire est une condition préalable cruciale pour comprendre les circuits neuronaux à l’échelle du cerveau. L’étude fonctionnelle des connexions à longue portée nécessite des enregistrements ciblés de neurones uniques combinés à la stimulation spécifique d’intrants éloignés identifiés. Ceci est souvent difficile à réaliser avec les techniques conventionnelles et de stimulation électrique, parce que les axones des zones convergentes du cerveau en amont peuvent se mêler dans la région cible. Le ciblage stéréotaxique d’une région spécifique du cerveau pour l’expression par le virus des canaux ioniques sensibles à la lumière permet la stimulation sélective des axones provenant de cette région avec la lumière. Les injections stéréotaxiques intracérébrales peuvent être utilisées dans des structures bien délimitées, telles que les noyaux thalamiques antérieurs, en plus d’autres zones sous-corticales ou corticales dans tout le cerveau.
Décrit ici est un ensemble de techniques pour l’injection stéréotaxique précise des vecteurs viraux exprimant la canalrhodopsine dans le cerveau de souris, suivie par la photostimulation des terminaux d’axone dans la préparation de tranche de cerveau. Ces protocoles sont simples et largement applicables. En combinaison avec l’enregistrement de pince de correction de pleine cellule d’un neurone postsynaptically relié, la photostimulation des axones permet la détection des connexions synaptiques fonctionnelles, la caractérisation pharmacologique, et l’évaluation de leur force. En outre, le remplissage de biocytine du neurone enregistré peut être employé pour l’identification morphologique post-hoc du neurone postsynaptic.
Introduction
Définir la connectivité entre les régions du cerveau est nécessaire pour comprendre les circuits neuronaux. Les méthodes classiques de traçage anatomique permettent d’établir une connectivité interrégionale, et les études sur les lésions aident à comprendre l’organisation hiérarchique du flux d’information. Par exemple, les circuits cérébraux pour l’orientation spatiale et la signalisation de direction de la tête impliquent le flux directionnel de l’information du thalamus au présubiculum. Ceci a été démontré par des études de lésion des noyaux thalamicants antéro-dorsal (ADN) qui dégradent le signal de direction de tête dans le presubiculum dorsal en aval, aussi bien que le signal de cellule de grille parahippocampal1,2.
La connectivité fonctionnelle entre les zones du cerveau est plus difficile à établir au niveau cellulaire et subcellulaire. Dans l’hippocampe, une anatomie très organisée permet d’étudier les connexions synaptiques spécifiques à la voie à l’aide de la simulation électrique dans la préparation des tranches. Les électrodes de stimulation placées dans le radiatum de strate de CA1 peuvent être utilisées pour stimuler spécifiquement l’entrée collatérale de Schaffer de CA33. Des électrodes stimulantes placées dans la strate lacunosum moleculare de CA1 activeront l’entrée de chemin de perforant à CA14,5. La stimulation électrique active la libération de neurotransmetteurdes des terminaux d’axone ; cependant, il active les neurones avec somata près du site de stimulation ainsi que des axones de passage. Il est donc d’une utilité limitée pour l’étude des afférents des régions définies du cerveau lorsque les fibres de différentes régions d’origine s’entremêlent dans la structure cible, comme c’est généralement le cas dans le néocortex.
Les neurones peuvent également être stimulés par la lumière. Les méthodes optiques incluent la photoactivation du glutamate en cage, qui peut être combinée avec un ou deux photons de balayage laser. Plusieurs sites étroitement espacés peuvent être stimulés séquentiellement, sans dommages mécaniques au tissu6. Ceci a été utilisé avec succès pour cartographier les récepteurs synaptiques ainsi que d’activer les neurones individuels7. Bien que le décaissement du glutamate puisse être utilisé pour l’analyse des circuits locaux, il ne permet pas l’activation spécifique des entrées à longue portée.
Une méthode de choix pour l’étude de la connectivité à longue portée dans les circuits neuronaux est l’utilisation de l’expression de canalrhodopsine virus-négociée. En utilisant des injections stéréotaxiques in vivo telles que décrites ici, l’expression des canaux ioniques à portes lumineuses peut être ciblée et spatialement limitée à une région du cerveau désirée. De cette façon, les channelrhodopsines sont efficaces pour cartographier la connectivité excitatrice ou inhibitrice d’une région à sa cible. Les terminaux d’axones transfectés peuvent être stimulés avec la lumière dans une préparation de tranche de cerveau, et les enregistrements de correction-clamp comme lecture-out permettent l’examen des fonctions et des forces des composants spécifiques de circuit dans le cerveau8. L’approche optogénétique combinée à l’injection stéréotaxique d’un virus offre une spécificité sans précédent et un contrôle génétique9. Stimuler avec la lumière permet en outre à la fois haute précision temporelle et spatiale10,11.
Le présubiculum est une structure corticale à six couches à la transition de l’hippocampe et de la formation para-hippocampal12,13. Il reçoit une entrée synaptique importante de l’ADN11, mais aussi de plusieurs autres régions corticales et sous-corticales14. Ainsi, la stimulation sélective des terminaux d’axones thalamic dans une tranche présubiculaire n’est pas possible avec la stimulation électrique ni le glutamate uncaging. Décrits dans ce protocole sont des méthodes pour déterminer la connectivité fonctionnelle entre les régions du cerveau (ADN et presubiculum) en utilisant des injections stéréotaxiques précises de vecteurs viraux exprimant des canaux à porte-lumière. On décrit également la photostimulation des terminaux d’axones des neurones projetants dans leur région cible, couplée aux enregistrements de patch-clamp de cellules entières des neurones post-synaptiques dans la préparation de tranche de cerveau.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’injection virale in vivo pour exprimer les opsines sensibles à la lumière dans une zone cérébrale définie est une méthode de choix pour l’analyse optogénétique de la connectivité fonctionnelle à longue portée10,11,17,18. Les injections stéréotaxiques offrent la possibilité de cibler précisément une zone spécifique du cerveau. La coexpression d’un opsin avec un journaliste flu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang et Jean Simonnet pour leur aide dans le développement des versions précédentes du protocole d’injection stéréotaxique et Marin Manuel et Patrice Jegouzo pour leur aide technique. Ce travail a été soutenu par le ministère Français de l’éducation et de la recherche (L. R., L. S.), le Centre national des Etudes Spatiales (M. B.) et l’Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
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