マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射
Summary
このプロトコルは、ex vivo脳スライスにおける光遺伝学的刺激を用いて、遠方の脳領域からの長距離入力の細胞型特異的機能的接続性を同定する一連の方法を説明する。
Abstract
細胞型特異的シナプス結合の知識は、脳全体の神経回路を理解するための重要な前提条件である。長距離接続の機能的調査では、特定された遠隔入力の特定の刺激と組み合わせた単一ニューロンの標的を絞った記録が必要です。上流の脳領域を収束させる軸が標的領域に混入する可能性があるため、従来の電気刺激技術では実現が困難な場合が多い。光感受性イオンチャネルのウイルス媒介発現のための特定の脳領域の立体標的は、光でその領域から発信された軸ゾンの選択的刺激を可能にする。脳内立体注射は、脳全体の他の皮質下または皮質領域に加えて、前視体核などの十分に区切られた構造で使用することができる。
ここでは、マウス脳中のチャネルロドプシンを発現するウイルスベクターの正確な立体注射のための技術のセットであり、続いて脳スライス調製における軸線末端の光刺激を行う。これらのプロトコルはシンプルで広く適用可能です。シナプス後に接続されたニューロンからの全細胞パッチクランプ記録と組み合わせることで、軸子の光刺激は、機能的シナプス接続の検出、薬理学的特性評価、および強度の評価を可能にします。さらに、記録されたニューロンのバイオシチン充填は、後のシナプス後ニューロンのポストホック形態学的同定に使用することができる。
Introduction
神経回路を理解するには、脳領域間の接続性を定義する必要があります。古典的な解剖学的トレース方法は、地域間接続を確立することを可能にし、病変研究は情報フローの階層的な組織を理解するのに役立ちます。例えば、空間的な向きと頭方向シグナリングのための脳回路は、視床から前亜皮への情報の方向流れを伴う。これは、下流の後部前subiculumにおける頭部方向信号を劣化させるアンテロドーサルタラミック核(ADN)の病変研究、ならびに海馬グリッド細胞信号1、2によって実証されている。
脳領域間の機能的な接続性は、細胞レベルと細胞内レベルで確立することがより困難です。海馬では、高度に組織化された解剖学により、スライス調製中の電気シミュレーションを使用して経路特異的シナプス接続を調べることができる。CA1の地層ラジエータムに配置された刺激電極は、CA333からのシャファー担保入力を特異的に刺激するために使用することができる。CA1の層ラクノサム分子に置かれた電極を刺激すると、CA14,5への穿開経路入力が活性化する。電気刺激はアクソン端子からの神経伝達物質の放出を活性化します。しかし、 刺激部位の近くにソマタを持つニューロンと通路の軸が活性化します。したがって、ネオコルテックスの場合と同様に、起源の異なる領域の繊維が標的構造内で混ざり合う場合、定義された脳領域からのアフェレントを研究するための使用は限られています。
ニューロンはまた、光で刺激されてもよいです.光学的方法には、ケージ付きグルタミン酸の光活性化が含まれており、これは1つまたは2つの光子レーザー走査と組み合わせることができる。複数の密接に間隔をあけた部位は、組織6に機械的損傷を与えなく、順次刺激されてもよい。これは、シナプス受容体をマッピングするだけでなく、個々のニューロン7を活性化するために正常に使用されています.グルタミン酸アンカシングは局所回路解析に使用できますが、長距離入力の特定の活性化は許可されません。
神経回路における長距離接続性の調査のための選択の方法は、ウイルス媒介性チャネルロドプシン発現の使用である。ここで説明するように生体内立体注射を用いて、光ゲートイオンチャネルの発現を標的とし、所望の脳領域に空間的に制限することができる。このように、チャネルロドプシンは、ある領域からその標的に興奮性または阻害性の接続性をマッピングするのに有効である。トランスフェクトされた軸子末端は、脳スライス調製中の光で刺激され、脳内の特定の回路成分の機能および強度を調べることができるように読み出しとしてパッチクランプ記録を行う。ウイルスの立体注射と組み合わせた光遺伝学的アプローチは、前例のない特異性と遺伝的制御9を提供しています。光で刺激することはさらに高い時間的および空間的な精密10、11を可能にする。
従属体は、海馬および海馬形成12,13の遷移における6層皮質構造である。これは、ADN11からだけでなく、いくつかの他の皮質および皮質下領域14から重要なシナプス入力を受け取ります。従って、前subasubs内のタラミック軸線端子の選択的刺激は、電気刺激またはグルタミン酸の無加分化では不可能である。このプロトコルに記載されているのは、光ゲートチャネルを発現するウイルスベクターの正確な立体注射を用いて脳領域(ADNおよび従属体)間の機能的接続性を決定する方法である。また、標的領域にニューロンを投影する軸子末端の光刺激と、脳スライス調製におけるシナプス後ニューロンの全細胞パッチクランプ記録についても説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
定義された脳領域で光感受性オプシンを発現する生体内ウイルス注射は、長距離機能的接続性10、11、17、18の光遺伝学的分析のための選択方法である。ステレオタキシック注射は、正確に脳の特定の領域をターゲットにする可能性を提供します.蛍光レポーターとのオプシンの共発現は、成功した?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ベルトラン・マトン、メリー・ナサール、Li-Wen Huang、ジャン・サイモンネットが、ステレオタキシック注射プロトコルの以前のバージョンの開発に協力し、マリン・マヌエルとパトリス・ジェグーゾに技術的な助けを与えてくださったことに感謝します。この研究は、フランスの教育研究省(L.R.、L.S.)、センター・ナショナル・デ・エチュード・スプライス(M.B.)、アジェンス・ナショナル・デ・ラ・レヒャーチェ・グラントANR-18-CE92-0051-01(D.F.)によって支援されました。
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
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