마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사
Summary
이 프로토콜은 생체 뇌 슬라이스에서 광유전학 자극을 사용하여 먼 뇌 영역에서 장거리 입력의 세포 유형 특정 기능적 연결을 식별하는 일련의 방법을 설명합니다.
Abstract
세포 형 특정 시냅스 연결의 지식은 뇌 전체 신경 회로를 이해하기위한 중요한 전제 조건입니다. 장거리 연결의 기능적 조사는 확인된 먼 입력의 특정 자극과 결합된 단 하나 뉴런의 표적으로 한 기록을 요구합니다. 이것은 종종 기존의 전기 자극 기술로 달성하기 어렵다, 수렴 에서 축색은 상류 뇌 영역을 혼합 할 수 있기 때문에 대상 영역에서 혼합 할 수 있습니다. 빛에 민감한 이온 채널의 바이러스 매개 표현을 위한 특정 뇌 영역의 입체 적 표적화는 빛으로 그 지역에서 유래 된 축전의 선택적 자극을 허용합니다. Intracerebral 입체 전염 주사는 두뇌를 통하여 그밖 피질 또는 피질 지역 이외에 전방 thalamic 핵과 같은 잘 분리된 구조물에서 이용될 수 있습니다.
여기서 설명된 것은 마우스 뇌에서 채널로도셉신을 발현하는 바이러스 벡터의 정확한 입체주입을 위한 기술세트이며, 이어서 뇌 슬라이스 제제에서 축사 말단의 광자극이 뒤따른다. 이러한 프로토콜은 간단하고 광범위하게 적용 가능합니다. 세포 내 로 연결된 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록과 결합하여 축삭의 광자극은 기능적 시냅스 연결, 약리학적 특성 및 강도 평가를 감지 할 수 있습니다. 또한, 기록된 뉴런의 바이오시틴 충진은 후배 형성 형 뉴런의 형태학적 식별에 사용될 수 있다.
Introduction
신경 회로를 이해하려면 뇌 영역 간의 연결을 정의하는 것이 필요합니다. 고전적인 해부학 추적 방법을 사용하면 지역 간 연결을 확립할 수 있으며 병변 연구는 정보 흐름의 계층 적 구성을 이해하는 데 도움이됩니다. 예를 들어, 공간 방향 및 머리 방향 신호에 대한 뇌 회로는 시상에서 구체로의 정보의 방향 흐름을 포함합니다. 이는 하류 등쪽 전구체에서 머리 방향 신호를 저하시키는 전방 등쪽 thalamic 핵(ADN)의 병변 연구뿐만 아니라 해마 격자 세포 신호1,2에의해 입증되었다.
뇌 영역 간의 기능적 연결은 세포 및 세포 내 수준에서 설정하는 것이 더 어렵습니다. 해마에서, 고도로 조직된 해부학은 슬라이스 준비에 있는 전기 시뮬레이션을 사용하여 통로 특정 시냅스 연결을 조사할 수 있습니다. CA1의 지층 라디에이터움에 배치된 자극 전극은CA333로부터샤퍼 부수적 입력을 구체적으로 자극하는데 사용될 수 있다. CA1의 지층 lacunosum 분자에 배치 자극 전극은 CA14,5에대한 천공 경로 입력을 활성화합니다. 전기 자극은 축슨 터미널에서 신경 전달 물질 방출을 활성화; 그러나, 그것은 통로의 축색뿐만 아니라 자극 부위 근처 소마타와 뉴런을 활성화. 따라서 전형적으로 신피질의 경우와 같이, 기원의 다른 영역의 섬유가 표적 구조에서 혼합될 때 정의된 뇌 영역에서 구심질을 연구하기 위한 제한된 사용이다.
뉴런은 또한 빛으로 자극될 수 있습니다. 광학 적 방법은 하나 또는 두 광자 레이저 스캐닝과 결합 될 수있는 케이지 조미료의 광 활성화를 포함한다. 여러 밀접하게 이격된 부위는 조직에 기계적 손상 없이 순차적으로 자극될 수 있다6. 이것은 성공적으로 시 냅 스 수용 체를 매핑 뿐만 아니라 개별 뉴런을 활성화 하는 데 사용 되었습니다7. 글루타메이트 무식은 로컬 회로 해석에 사용될 수 있지만 장거리 입력의 특정 활성화는 허용되지 않습니다.
신경 회로에서 장거리 연결의 조사를 위한 선택의 방법은 바이러스 매개 채널로도프신 발현의 사용이다. 여기에 설명된 바와 같이 생체 내 입체 주사를 사용하여, 광 문이 닫힌 이온 채널의 발현은 원하는 뇌 영역으로 표적화되고 공간적으로 제한될 수 있다. 이러한 방식으로, 채널러도셉신은 한 영역에서 표적으로 흥분제 또는 억제 연결을 매핑하는 데 효과적이다. 형질감염된 축사 단자는 뇌 슬라이스 제제에서 빛으로 자극될 수 있고, 판독으로 패치 클램프 기록은 뇌의 특정 회로 성분의 기능 및 강점을 검사할 수 있다8. 바이러스의 입체 적 주입과 결합 된 광유전학적 접근법은 전례없는 특이성 및 유전 적 대조군9을제공합니다. 빛을 자극하면 시간적 및 공간 적정밀도가 10,11로높아집니다.
예비는 해마및 파라해마 형성의 전이에서 6층 피질 구조이다12,13. 그것은 ADN11에서 중요한 시냅스 입력을 수신하지만 또한 몇몇 다른 피질 및 피질 영역(14)에서. 따라서, 서브실 슬라이스 내의 탈라믹 축사 단자의 선택적 자극은 전기 자극이나 글루타메이트 무형화로는 불가능하다. 이 프로토콜에 설명된 방법은 빛 문이 닫힌 채널을 발현하는 바이러스 벡터의 정확한 입체 적 주사를 사용하여 뇌 영역 (ADN 및 presubiculum) 사이의 기능적 연결을 결정하는 방법입니다. 또한 설명된 것은 뇌 슬라이스 제제에서 시냅스 후 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록과 결합된 표적 영역에서 뉴런을 투사하는 축세포 말단의 광자극이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
정의된 뇌 영역에서 빛에 민감한 옵신을 발현하는 생체내 바이러스 주사는 장거리 기능적 연결성10,11,17,18의광유전학적 분석을 위한 선택방법이다. 스테레오택시 주사는 정확하게 뇌의 특정 영역을 대상으로 할 수있는 가능성을 제공합니다. 형광 리포터와 함께 opsin의 공동 발현은 정확한 주사 부위?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 버트 랜드 마톤, 메리 나사르, 리 웬 황, 그리고 장 시몬넷은 기술적 인 도움을 위한 스테레오 탁시컬 주입 프로토콜과 마린 마누엘과 파트리스 제구조의 이전 버전의 개발에 도움을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 교육 및 연구 프랑스 교육부에 의해 지원되었다 (L. R., L. S.), 센터 국립 데 에뛰데스 공간 (M. B.), 및 기관 국립 드 라 레처 그랜트 ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
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