In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices
Summary
Este protocolo describe un conjunto de métodos para identificar la conectividad funcional específica de tipo celular de entradas de largo alcance de regiones cerebrales distantes utilizando estimulaciones optogenéticas en rebanadas cerebrales ex vivo.
Abstract
El conocimiento de la conectividad sináptica específica de tipo celular es un requisito previo crucial para comprender los circuitos neuronales de todo el cerebro. La investigación funcional de conexiones de largo alcance requiere registros específicos de neuronas individuales combinadas con la estimulación específica de entradas distantes identificadas. Esto es a menudo difícil de lograr con las técnicas de estimulación convencionales y eléctricas, porque los axones de las áreas cerebrales ascendentes convergentes pueden entremezclarse en la región objetivo. La orientación estereotaxcde de una región cerebral específica para la expresión mediada por virus de canales iónicos sensibles a la luz permite la estimulación selectiva de axónes procedentes de esa región con luz. Las inyecciones estereoónicas intracerebrales se pueden utilizar en estructuras bien delimitadas, como los núcleos talámicos anteriores, además de otras áreas subcorticales o corticales en todo el cerebro.
Aquí se describe un conjunto de técnicas para la inyección estereoopónica precisa de vectores virales que expresan la cifrodonina en el cerebro del ratón, seguido de la fotoestimulación de los terminales de axón en la preparación de la rebanada del cerebro. Estos protocolos son simples y ampliamente aplicables. En combinación con la grabación de abrazaderas de parche de células enteras de una neurona conectada postsinánicamente, la fotoestimulación de los axons permite la detección de conexiones sinápticas funcionales, caracterización farmacológica y evaluación de su fuerza. Además, el llenado de biocitetina de la neurona registrada se puede utilizar para la identificación morfológica post-hoc de la neurona postsináptica.
Introduction
Definir la conectividad entre las regiones cerebrales es necesario para entender los circuitos neuronales. Los métodos clásicos de rastreo anatómico permiten establecer la conectividad interregional, y los estudios de lesiones ayudan a entender la organización jerárquica del flujo de información. Por ejemplo, los circuitos cerebrales para la orientación espacial y la señalización de la dirección de la cabeza implican el flujo direccional de información desde el tálamo hasta el presubiculum. Esto ha sido demostrado por estudios de lesiones de núcleos talámicos antero-dorsales (ADN) que degradan la señal de dirección de la cabeza en el presubiculo dorsal aguas abajo, así como la señal celular de la red parahipocampal1,2.
La conectividad funcional entre las áreas cerebrales es más difícil de establecer a nivel celular y subcelular. En el hipocampo, una anatomía altamente organizada permite investigar conexiones sinápticas específicas de la vía utilizando la simulación eléctrica en la preparación de la rebanada. Los electrodos de estimulación colocados en el estrato radiato de CA1 se pueden utilizar para estimular específicamente la entrada colateral de Schaffer de CA33. Los electrodos estimulantes colocados en el lacunos molecular e estrato de CA1 activarán la entrada de trayectoria perforante a CA14,5. La estimulación eléctrica activa la liberación de neurotransmisores de los terminales de axón; sin embargo, activa las neuronas con somata cerca del sitio de estimulación, así como axones de paso. Por lo tanto, es de uso limitado para el estudio de afferents de regiones cerebrales definidas cuando las fibras de diferentes regiones de origen se entremezclan en la estructura objetivo, como es típicamente el caso en el neocórtex.
Las neuronas también pueden estimularse con luz. Los métodos ópticos incluyen la fotoactivación del glutamato enjaulado, que se puede combinar con el escaneo láser de uno o dos fotones. Múltiples sitios estrechamente espaciados pueden ser estimulados secuencialmente, sin daño mecánico al tejido6. Esto se ha utilizado con éxito para mapear receptores sinápticos, así como activar las neuronas individuales7. Mientras que el desafiamiento de glutamato se puede utilizar para el análisis de circuitos locales, no permite la activación específica de entradas de largo alcance.
Un método de elección para la investigación de la conectividad de largo alcance en circuitos neuronales es el uso de la expresión de canalizarpsina mediada por virus. Utilizando inyecciones estereotaxócicas in vivo como se describe aquí, la expresión de canales iónicos bloqueados por la luz puede ser dirigida y restringida espacialmente a una región cerebral deseada. De esta manera, las clasrodoninas son eficaces para mapear la conectividad excitatoria o inhibitoria de una región a su objetivo. Los terminales de axón transfectó pueden estimularse con luz en una preparación de corte cerebral, y las grabaciones de abrazaderas de parche como una lectura permiten el examen de las funciones y fortalezas de los componentes específicos del circuito en el cerebro8. El enfoque optogenético combinado con la inyección estereotaxia de un virus ofrece una especificidad sin precedentes y un control genético9. Estimular con la luz además permite una alta precisión temporal y espacial10,11.
El presubiculum es una estructura cortical de seis capas en la transición del hipocampo y la formación para-hipopótamo12,13. Recibe importantes aportaciones sinápticas del ADN11, pero también de varias otras regiones corticales y subcorticales14. Por lo tanto, la estimulación selectiva de terminales de axones talámicos dentro de una rebanada presubicular no es posible con la estimulación eléctrica ni el desatonación de glutamato. En este protocolo se describen métodos para determinar la conectividad funcional entre las regiones cerebrales (ADN y presubiculum) utilizando inyecciones estereoofócicas precisas de vectores virales que expresan canales de luz cerrada. También se describe la fotoestimulación de los terminales de axón de las neuronas que se proyectan en su región objetivo, junto con las grabaciones de abrazaderas de parche de células enteras de las neuronas postsinápticas en la preparación de la rebanada del cerebro.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inyección viral in vivo para expresar opsins sensibles a la luz en un área cerebral definida es un método de elección para el análisis optogenético de conectividad funcional de largo alcance10,11,17,18. Las inyecciones estereootaxias ofrecen la posibilidad de apuntar con precisión a un área específica del cerebro. La coexpresión de una opsin con un reportero fluorescente permite co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang y Jean Simonnet por su ayuda en el desarrollo de versiones anteriores del protocolo de inyección estereotaxia y Marin Manuel y Patrice Jegouzo por su ayuda técnica. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio francés de Educación e Investigación (L. R., L. S.), el Centre National des Etudes Spatiales (M. B.) y agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
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