In vivo intracerebral Stereotaxic injektioner för Optogenetisk stimulering av långväga ingångar i mushjärna skivor
Summary
Detta protokoll beskriver en uppsättning metoder för att identifiera den cell-typ specifik funktionell anslutning av långväga ingångar från avlägsna hjärnregioner med hjälp av optogenetiska stimuleringar i ex vivo hjärn skivor.
Abstract
Kunskap om cell-typ specifik synaptisk anslutning är en avgörande förutsättning för att förstå hjärnans hela neuronala kretsar. Den funktionella utredningen av långväga anslutningar kräver riktade inspelningar av enstaka nervceller i kombination med den specifika stimulering av identifierade avlägsna ingångar. Detta är ofta svårt att uppnå med konventionell och elektrisk stimulering tekniker, eftersom axoner från konvergerande uppströms hjärnområden kan blandas i målregionen. Stereotaxic-inriktningen av en specifik hjärnregion för virusmedierat uttryck av ljuskänsliga jonkanaler möjliggör selektiv stimulering av axoner som kommer från den regionen med ljus. Intracerebral stereotaxic injektioner kan användas i väl avgränsade strukturer, såsom främre thalamic kärnor, förutom andra subkortikala eller kortikala områden i hela hjärnan.
Beskrivs här är en uppsättning tekniker för exakt stereotaxic injektion av virala vektorer uttrycker channelrhodopsin i mushjärna, följt av photostimulation av axon terminaler i hjärnan slice beredning. Dessa protokoll är enkla och allmänt tillämpliga. I kombination med hela-cell patch klämma inspelning från en postsynaptically ansluten neuron, photostimulation av axoner gör det möjligt att upptäcka funktionella synaptiska anslutningar, farmakologiska karakterisering, och utvärdering av deras styrka. Dessutom kan biocytin fyllning av den inspelade neuron användas för post-hoc morfologisk identifiering av postsynaptiska neuron.
Introduction
Definiera anslutning mellan hjärnregioner är nödvändigt att förstå neurala kretsar. Klassiska anatomiska spårningsmetoder gör det möjligt att etablera interregionala anslutningar och lesionsstudier hjälper till att förstå den hierarkiska organisationen av informationsflödet. Till exempel hjärnkretsar för rumslig orientering och huvudriktning signalering innebär riktad flödet av information från thalamus till presumbiculum. Detta har visats genom lesionsstudier av Antero-dorsala thalamic kärnor (ADN) som försämrar huvud riktnings signalen i nedströms dorsala presumbiculum, liksom parahippocampal Grid cell signal1,2.
Den funktionella anslutningen mellan hjärnområden är svårare att etablera sig på en cellulär och subcellulär nivå. I hippocampus, en mycket organiserad anatomi gör det möjligt att undersöka Pathway-specifika synaptiska anslutningar med hjälp av elektrisk simulering i segmentet förberedelse. Stimulering elektroder placeras i stratum radiatum av CA1 kan användas för att specifikt stimulera Schaffer säkerheter input från CA33. Stimulerande elektroder placerade i stratum lacunosum moleculare av CA1 kommer att aktivera perforant Path input till CA14,5. Elektrisk stimulering aktiverar signalsubstansen frisättning från Axon terminaler; emellertid, det aktiverar nervceller med Somata nära stimulering webbplats samt axoner passage. Det är därför av begränsad användning för att studera afferenter från definierade hjärnregioner när fibrer av olika ursprungsregioner blandas i målstrukturen, vilket är typiskt fallet i hjärnbarken.
Nervceller kan också stimuleras med ljus. Optiska metoder inkluderar ljusaktivering av bur Glutamat, som kan kombineras med en-eller två-Photon laserskanning. Flera tätt placerade platser kan stimuleras sekventiellt, utan mekaniska skador på vävnaden6. Detta har framgångsrikt använts för att kartlägga synaptiska receptorer samt aktivera enskilda nervceller7. Medan glutamat uncaging kan användas för lokal krets analys, det tillåter inte för specifik aktivering av långväga ingångar.
En metod att välja för utredning av långväga anslutning i neuronala kretsar är användningen av virumedierade channelrhodopsin uttryck. Använda in vivo stereotaxic injektioner som beskrivs här, uttrycket av ljus-gated jonkanaler kan riktas och rumsligt begränsas till en önskad hjärnregion. På så sätt är channelrhodopsins effektiva för att kartlägga excitatoriska eller hämmande anslutningar från en region till målet. Transfected axoner terminaler kan stimuleras med ljus i en hjärna slice förberedelse, och patch-klämma inspelningar som en Read-out möjliggör undersökning av funktioner och styrkor av specifika kretskomponenter i hjärnan8. Den optogenetiska metoden kombinerat med stereotaxic injektion av ett virus erbjuder oöverträffad specificitet och genetisk kontroll9. Stimulerande med ljus ger dessutom både hög tidsmässig och rumslig precision10,11.
Den presumbiculum är en sex lager kortikala struktur vid övergången av hippocampus och para-hippocampal formation12,13. Det mottar viktigt Synaptic matar in från ADN11 men också från flera andra kortikala och subkortikala regioner14. Sålunda, selektiv stimulering av thalamic axoner terminaler inom en presumbicular slice är inte möjligt med elektrisk stimulering eller glutamat uncaging. Beskrivs i detta protokoll är metoder för att fastställa funktionell anslutning mellan hjärnregioner (ADN och presumbiculum) med hjälp av exakta stereotaxic injektioner av virala vektorer uttrycker ljus-gated kanaler. Beskrivs också är photostimulation av axoner terminaler av projicering av nervceller i deras mål region, i kombination med hela cellen patch-klämma inspelningar av post-synaptiska neuroner i hjärnan slice förberedelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo viral injektion för att uttrycka ljuskänsliga opsins i ett definierat hjärnområde är en val metod för optogenetisk analys av lång räckvidd funktionell anslutning10,11,17,18. Stereotaxic injektioner erbjuder möjligheten att exakt rikta ett specifikt område i hjärnan. Den coexpression av en opsin med en fluorescerande reporter möjliggör praktiskt utvärdering av det framgång…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang, och Jean SIMONNET för deras hjälp i utvecklingen av tidigare versioner av stereotaxic Injection Protocol och marin Manuel och Patrice Jegouzo för teknisk hjälp. Detta arbete stöddes av det franska ministeriet för utbildning och forskning (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.), och Agence nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Huang, L. -. W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
