Metoder for å teste endokrine forstyrrelser i Drosophila melanogaster

Summary

Endokrine disruptor kjemikalier (EDCs) representerer et alvorlig problem for organismer og for naturlige miljøer. Drosophila melanogaster representerer en ideell modell for å studere EDC effekter in vivo. Her presenterer vi metoder for å undersøke endokrine forstyrrelser i Drosophila, adressering EDC effekter på fekunditet, fruktbarhet, utviklingsmessige timing, og levetid på fly.

Abstract

I de senere årene har det vært økende bevis for at alle organismer og miljøet er eksponert for hormon-lignende kjemikalier, kjent som endokrine disruptor kjemikalier (EDCs). Disse kjemikaliene kan endre den normale balansen av endokrine systemer og føre til bivirkninger, samt et økende antall hormonelle lidelser i den menneskelige befolkning eller forstyrret vekst og redusert reproduksjon i dyrelivet arter. For noen EDCs, det er dokumentert helseeffekter og restriksjoner på bruken. Men for de fleste av dem, er det fortsatt ingen vitenskapelige bevis i denne forstand. For å verifisere potensielle endokrine effekter av en kjemisk i hele organismen, må vi teste den i riktig modellsystemer, så vel som i frukten fly, Drosophila melanogaster. Her rapporterer vi detaljert in vivo protokoller for å studere endokrine forstyrrelser i Drosophila, adressering EDC effekter på fekunditet/fruktbarhet, utviklingsmessige timing, og levetid på fly. I de siste årene, brukte vi disse Drosophila liv egenskaper for å undersøke virkningene av eksponering for 17-α-etinyløstradiol (EE2), bisfenol A (BPA), og bisfenol AF (BPA F). Tilsammen, disse analysene dekket alle Drosophila liv stadier og gjorde det mulig å evaluere endokrine forstyrrelser i alle hormon-mediert prosesser. Fekunditet/fruktbarhet og utviklingsmessige timing analysene var nyttige for å måle EDC innvirkning på fly reproduktiv ytelse og på utviklingsmessige stadier, henholdsvis. Til slutt, levetid analysen involvert kroniske EDC eksponeringer til voksne og målte deres survivorship. Men disse livet egenskaper kan også være påvirket av flere eksperimentelle faktorer som måtte være nøye kontrollert. Så, i dette arbeidet, foreslår vi en rekke prosedyrer vi har optimalisert for riktig utfall av disse analysene. Disse metodene tillater forskere å etablere endokrine avbrudd for noen EDC eller for en blanding av ulike EDCs i Drosophila, men å identifisere den endokrine mekanismen ansvarlig for effekten, ytterligere essays kan være nødvendig.

Introduction

Menneskelige aktiviteter har blitt sluppet ut i miljøet en massiv mengde kjemikalier, som representerer et alvorlig problem for organismer og for naturlige økosystemer¹. Av disse forurensende stoffer, er det anslått at om 1 000 forskjellige kjemikalier kan endre den normale balansen av endokrine systemer; henhold til denne eiendommen, er de klassifisert som endokrine forstyrre kjemikalier (EDCs). Nærmere bestemt, basert på en nylig definisjon av det endokrine samfunn, EDCs er “en eksogene kjemisk, eller blanding av kjemikalier, som kan forstyrre noen aspekter av hormon handling”². I løpet av de siste tre ti årene har det vært økende vitenskapelige bevis for at EDCs kan påvirke reproduksjon og utvikling av dyr og planter^{3,4,5,6,7, 8}i den. Videre har EDC eksponering vært knyttet til den økende utbredelsen av noen menneskelige sykdommer, inkludert kreft, fedme, diabetes, skjoldbrusk sykdommer, og atferdsforstyrrelser^9,10,11.

Generelle mekanismer for EDC

På grunn av deres molekylære egenskaper, EDCs oppfører seg som hormoner eller hormon preK UrsOrer³,⁴,^5,6,7,^{8,9, 10,11,12}. I denne forstand, de kan binde til et hormon reseptor og forstyrre endokrine systemer enten ved å etterligne hormon aktivitet eller ved å blokkere endogene hormoner bindende. I det første tilfellet, etter binding til reseptoren, de kan aktivere det som sin naturlige hormonet ville gjøre. I det andre tilfellet, binding av EDC til reseptoren hindrer bindingen av sin naturlige hormon, slik at reseptoren er blokkert og kan ikke lenger aktiveres, selv i nærvær av sin naturlige hormon³. Som en konsekvens, EDCs kan påvirke flere prosesser, for eksempel syntese, sekresjon, transport, metabolisme, eller perifere handling av endogene hormoner som er ansvarlig for vedlikehold av homeostase, reproduksjon, utvikling, og/eller atferd av organismen. Reseptor binding er ikke den eneste handlingsmåten som beskrives så langt for EDCs. Det er nå klart at de kan også fungere ved å rekruttere coactivators eller corepressors i enzymatisk trasé eller ved å endre epigenetic markører deregulating genuttrykk^{10,11,12,13 ,14}, med konsekvenser ikke bare for den nåværende generasjonen, men også for helsen til generasjoner framover⁸.

Drosophila hormoner

Den potensielle effekten av utvalgte EDCs har blitt studert mye, både i dyrearter og i flere modellsystemer der endokrine mekanismer er rimelig godt kjent. For virvelløse dyr, endokrine systemer som påvirker vekst, utvikling og reproduksjon har vært omfattende preget i insekter av flere grunner, som involverer deres omfattende bruk innen biologisk forskning, deres økonomiske betydning, og endelig utvikling av insektmidler i stand til å forstyrre spesielt med hormon systemet av pest insekter.

Spesielt blant insekter, frukten fly D. melanogaster har vist seg å være en svært kraftig modell system for å evaluere den potensielle endokrine effekten av EDCs. I D. melanogaster, så vel som i virveldyr, hormoner spille en viktig rolle gjennom hele livssyklusen. I denne organismen, det er tre viktigste hormonelle systemer, som involverer steroid hormonet 20-hydroxyecdysone (20e)^15,16, sesquiterpenoid juvenile Hormone (JH)¹⁷, og nevropeptider og peptid/protein hormoner¹⁸. Denne tredje gruppen består av flere peptider oppdaget mer nylig, men tydelig involvert i et stort utvalg av fysiologiske og atferdsmessige prosesser, slik som lang levetid, homeostase, metabolisme, reproduksjon, minne og Locomotor kontroll. 20E er homologe til kolesterol-avledet steroid hormoner som østradiol, mens JH aksjer noen likheter med retinoic syre; begge er de bedre kjente hormonene i Drosophila^19,20. Deres balanse er viktig å koordinere molting og forvandling, samt i å kontrollere flere postdevelopmental prosesser, slik som reproduksjon, levetid, og atferd²¹, og dermed tilbyr ulike muligheter for testing endokrine forstyrrelser i Drosophila. Videre, ecdysteroid hormoner og JHs er de viktigste målene for den såkalte tredje generasjons insektmidler, utviklet for å forstyrre utviklingsmessige og reproduktive endokrine-mediert prosesser i insekter. Den Agonistiske eller motstander modus av handlingen av disse kjemikaliene er godt kjent, og dermed kan de tjene som referanse standarder for å evaluere effekten av potensielle EDCs på vekst, reproduksjon, og utvikling av insekter²². For eksempel, methoprene, som har vært mye brukt i kontrollerende mygg og andre akvatiske insekter^23,24, fungerer som en JH Agonistiske og fortrenger 20e-indusert genet transkripsjon og forvandling.

I tillegg til hormoner, den kjernefysiske reseptor (NR) overfamilie i Drosophila er også godt kjent; Det består av 18 evolutionarily bevart transkripsjon faktorer involvert i kontrollerende hormon avhengig utviklingsmessige trasé, samt reproduksjon og fysiologi²⁵. Disse hormon NRs tilhører alle seks NR overfamilie under typer, inkludert de som er involvert i neurotransmission²⁶, to for retinoic acid NRS, og de for steroid NRS som, i virveldyr, representerer en av de primære målene for EDCs²⁷.

Drosophila som et modell system for å studere EDCs

For tiden, på grunnlag av molekylære egenskaper, flere miljø etater rundt om i verden er tildele potensialet til å forstyrre de endokrine systemer til ulike menneskeskapte kjemikalier. Gitt at EDCs er et globalt og allestedsnærværende problem for miljøet og for organismer, er det overordnede målet for forskningen på dette feltet for å redusere deres sykdoms byrde, samt å beskytte levende organismer fra deres bivirkninger. For å utdype forståelsen om de potensielle endokrine virkningene av en kjemisk, er det nødvendig å teste den in vivo. For dette formål representerer D. melanogaster et gyldig modell system. Hittil har frukten fly blitt mye brukt som in vivo-modell for å evaluere virkningene av flere miljømessige EDCs; Det har blitt rapportert at eksponering for flere EDCs, for eksempel dibutyl ftalat (DBP)²⁸, bisfenol A (BPA), 4-nonylfenol (4-np), 4-tert-octylphenol (4-TERT-op)²⁹, metylparaben (MP)³⁰, ethylparaben (EP)^{31, 32}, BIS-(2-etylheksyl) FTALAT (DEHP)³³, og 17-α-etinyløstradiol (EE2)³⁴, påvirkninger metabolisme og endokrine funksjoner som i virveldyr modeller. Flere grunner har ført til sin bruk som en modell på dette forskningsområdet. Utover en god kjennskap til sine endokrine systemer, ytterligere fordeler inkluderer sin korte livssyklus, lave kostnader, lett manipulable Genova, en lang historie med forskning, og flere tekniske muligheter (se FlyBase nettsted, http://flybase.org/). D. melanogaster gir også en kraftig modell for enkelt å studere transgenerational effekter og befolknings reaksjoner på miljøfaktorer⁸ og unngår etiske problemstillinger som er relevante for in vivo-studier hos høyere dyr. I tillegg har frukten fly aksjer en høy grad av gen bevaring med mennesker som kan gjøre det mulig for Drosophila EDC analyser for å hjelpe med å forutsi eller foreslå potensielle virkningene av disse kjemikaliene for menneskers helse. Foruten å utvide forståelsen om menneskers helseeffekter, kan Drosophila bidra til å vurdere risikoen for EDC eksponering for miljøet, slik som tap av biologisk mangfold og miljøødeleggelser. Til slutt tilbyr frukten fly den ekstra fordelen av å være brukt i laboratorier, hvor de faktorer som potensielt påvirker sin utvikling, reproduksjon, og levetid kan holdes under kontroll for å tillegge enhver variasjon til stoffet som skal testes.

Med dette i bakhodet, har vi optimalisert enkle og robuste fitness analyser for å bestemme EDC effekter på noen Drosophila hormonelle egenskaper, slik som fekunditet/fruktbarhet, utviklingsmessige timing, og voksen levetid. Disse analysene har blitt mye brukt i noen EDCs^{23, 24,25,26,27}. Spesielt har vi brukt følgende protokoller for å evaluere effekten av eksponeringen til syntetisk østrogen EE2³⁴ og til BPA og til bisfenol AF (BPA F) (upubliserte data). Disse protokollene kan lett endres for å undersøke virkningene av en gitt EDC om gangen, samt den kombinerte effekten av flere EDCs i D. melanogaster.

Protocol

1. matlaging For lager vedlikehold og for larvestadiet vekst, bruk et cornmeal medium som inneholder 3% pulverisert gjær, 10% sukrose, 9% precooked cornmeal, 0,4% agar, deretter kalt cornmeal medium (CM). Sett 30 g gjær i 100 mL vann fra springen, bringe den til en byll og la det koke i 15 min. Separat, bland godt 90 g precooked cornmeal, 100 g sukker, og 4 g av agar inn 900 mL vann fra springen. Bring løsningen til en byll, Senk varmen og stek i 5 minutter s…

Representative Results

I denne delen er viktige trinn i protokollene ovenfor rapportert i form av forenklede ordninger. Gitt at fluer har en tendens til å unngå usmakelig forbindelser, den første tingen å gjøre er å analysen smaken av den valgte EDC. Dette kan gjøres ved å blande en konditorfarge (for eksempel rød mat Dye nr. 40)35 med maten supplert med den valgte EDC på ulike doser eller med løsemiddel alene. Fluer matet på disse mediene er undersøkt under en stereomikroskopet og matinntaket er anslått a…

Discussion

Frukten fly D. melanogaster har vært utstrakt ansatt som et in vivo-modell system for å undersøke de potensielle virkningene av miljø EDCS som DBP²⁸, BPA, 4-NP, 4-tert-op²⁹, MP³⁰, EP^{31, 32}, DEHP³³og EE2³⁴. Flere grunner har ledet sin bruk som en modell på dette forskningsområdet. Bortsett fra dens ubestridte fordeler som et model…

Materials

17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Bisphenol A	Sigma	239658-50G
Bisphenol AF	Sigma	90477-100MG
Cornmeal	CA' BIANCA
Diethyl ether	Sigma
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25×95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29×95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22X63
Embryo collection cage	Crafts		Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol	FLUKA	2860
Etherizer	Crafts		cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle			250mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	FLAT BOTTOM TUBE 100X24
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Laying tray	Crafts		plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Petri Dish	Falcon	351016	60×5
Red dye no. 40	SIGMA	16035
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Tomato sauce	Cirio