Beoordeling van de cellulaire immuunrespons van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, met behulp van een In Vivo fagocytose Assay

Summary

Dit protocol beschrijft een in vivo fagocytose assay in volwassen Drosophila melanogaster te kwantificeren fagocytensysteem erkenning en goedkeuring van de microbiële infecties.

Abstract

Bij alle dieren biedt aangeboren immuniteit een onmiddellijke en robuuste verdediging tegen een breed spectrum aan pathogenen. Humorale en cellulaire immuunresponsen zijn de belangrijkste takken van aangeboren immuniteit, en veel van de regulering van deze reacties factoren evolutionair tussen ongewervelden en zoogdieren zijn bewaard. Fagocytose, de centrale component van cellulaire aangeboren immuniteit, wordt uitgevoerd door gespecialiseerde bloed cellen van het immuunsysteem. De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, heeft ontpopt als een krachtige genetisch model om de moleculaire mechanismen en de fysiologische effecten van fagocytose in hele dieren te onderzoeken. Hier laten we zien een in vivo fagocytose injectie gebaseerde bepaling om te kwantificeren van de particle opname en vernietiging door de cellen van het bloed van de Drosophila , hemocytes. De procedure kan onderzoekers te regelen het deeltje concentratie en dosis, waardoor het kan zeer reproduceerbare resultaten te verkrijgen in een korte hoeveelheid tijd precies. Het experiment is kwantitatieve, gemakkelijk uit te voeren, en kunnen worden toegepast om te screenen op gastheer factoren die invloed pathogen erkenning, opname en goedkeuring.

Introduction

Aangeboren immuun afweer vormen de eerste lijn van verdediging tegen pathogene microben. Deze reacties kunnen functioneel worden onderverdeeld in humorale en cellulaire aangeboren immuniteit, die beide worden gemedieerd door germline-gecodeerde patroon erkenning receptoren (PRRs) die zin pathogen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs)¹. Veel van de signaalroutes en effector mechanismen van aangeboren immuniteit zijn bewaard in zoogdieren en ongewervelden, zoals de nematode, Caenorhabditis elegans, en de fruitvlieg, Drosophila melanogaster². De fruitvlieg heeft ontpopt als een krachtig systeem te bestuderen host verdediging tegen infectieuze micro-organismen³. Drosophila is genetisch hanteerbare, gemakkelijk en goedkoop een ziek rund opgefokt in laboratoria, en heeft een korte generatietijd. Bovendien vertoont de fruitvlieg hoogefficiënte verdedigingen tegen een array van microben, waardoor het onderzoek van de immuniteit van de gastheer tegen virale, bacteriële, schimmel of parasitische ziekteverwekkers.

Drosophila immunologen hebben historisch gebruikt voorwaartse genetische schermen, genoom-brede RNA-gemedieerde interferentie (RNAi) screening van insecten cellijnen, en reeds bestaande mutant vliegen stammen te onderzoeken van aangeboren immuniteit – leidt tot de identificatie en karakterisering van verschillende evolutionair geconserveerde humorale immune trajecten^4,5,6,7,8. De humorale ingeboren immune reactie is, misschien wel, de beste gekenmerkt immuunsysteem verdediging in fruitvliegjes. Na infectie leidt de humorale respons op de productie en de systemische release van antimicrobiële peptide (AMP) moleculen in de Hemolymfe, het bloed gelijk bij insecten. Versterkers zijn geproduceerd door zeer geconserveerde tol en Imd signalering trajecten. De tol-traject is homoloog aan zoogdieren TLR/IL-1R receptor signalering en de Imd-traject is homoloog aan zoogdieren Tumornecrosefactor-alfa signalering. In Drosophila, tol signalering wordt geïnduceerd door gram-positieve bacteriën, schimmels en Drosophila X virus^6,9,10 en Imd signalering wordt veroorzaakt door gramnegatieve bacteriën^{11 ,12}.

Cellulaire immuniteit, samengesteld uit inkapselen, melanization en fagocytose van invasieve pathogenen, uitgevoerd door gespecialiseerde bloedcellen genaamd hemocytes¹³. Er zijn drie klassen van hemocytes in de fruitvlieg: crystal cellen, lamellocytes en plasmatocytes¹³. Crystal cellen, die make-up van 5% van het circulerende hemocytes in larven, vrij proPhenoloxidase (tot) enzymen leidt tot de melanization van pathogenen en host weefsels op wond sites. Lamellocytes, die niet normaal te in gezonde embryo’s of larven vinden, zijn Adherente cellen die vreemde voorwerpen kapselen. Deze cellen worden veroorzaakt bij pupariation of bij parasitizing wasp eieren worden afgezet in de larven. Fagocytische plasmatocytes, die 95 procent van de circulerende hemocytes in larven en alle overige hemocytes bij volwassenen, een rol spelen in de weefsel remodeling tijdens de ontwikkeling en, met name, dienen als de belangrijkste effector cel van Drosophila cellulaire immuniteit.

Fagocytose een onmiddellijke en cruciale lijn van het aangeboren immuunsysteem verdediging; microben die inbreuk op de host epitheliale barrière zijn snel overspoeld en geëlimineerd door fagocytische cellen van het bloed (zie referentie ¹⁴voor een algehele herziening van de celbiologie van fagocytose). Dit proces wordt gestart wanneer germline-gecodeerde patroonherkenning receptoren (PRRs) op hemocytes herkennen pathogen moleculaire patronen (PAMPs) van microben verbonden. Eenmaal gebonden aan hun doelstellingen, initiëren PRRs signalering cascades die tot de vorming van pseudopods via het remodelleren van actine cytoskelet leiden. De pseudopods rondom de microbe, die vervolgens overspoeld en geïnternaliseerd in een ontluikende organel, de phagosome. Microben zijn vernietigd zoals de phagosome het proces van rijping van de phagosome ondergaat wanneer de phagosome is verhandeld naar de binnenzijde van de hemocyte en door middel van een reeks interacties met lysosomen verzuurt. In vitro en cel zijn biologie onderzoek bij zoogdiercellen primaire instrumentale bij de identificatie en karakterisering van de factoren die fagocytose, zoals de zoogdieren Fc-gamma receptor en C3b receptoren^{15,16 regelen}geweest. Echter de mogelijkheid grote schermen of in vivo onderzoek uit te voeren zijn beperkt in zoogdieren systemen.

Hier presenteren we een in vivo assay voor fagocytose in volwassen fruitvliegen, die is gebaseerd op een procedure voor het eerst geïntroduceerd door het laboratorium van David Schneider in 2000¹⁷. Het Schneider-lab bleek dat sessiele hemocytes geclusterd langs de buik dorsale vaartuig gemakkelijk phagocytose polystyreen kralen en bacteriën. Om te visualiseren fagocytose, vliegen worden geïnjecteerd met fluorescently geëtiketteerde deeltjes (zoals E. coli aangeduid met fluoresceïne-isothiocyanaat (E. coli –FITC)), gedurende 30 minuten tot de hemocytes tijd te verzwelgen de deeltjes, geïncubeerd en vervolgens ingespoten met trypan blauw, die de fluorescentie van deeltjes niet phagocytosed tijdens de incubatieperiode lest. Vliegen dorsale schepen zijn dan beeld met behulp van een omgekeerde fluorescente microscoop. Deze baanbrekende papier, met behulp van een relatief eenvoudig experiment, aangetoond dat hemocytes phagocytose bacteriën en latex kralen, dat bacteriële fagocytose kunnen worden geremd door het injecteren van vooraf vliegt met latex kralen, en dat zonder zowel cellulaire en humorale vliegt immuunresponsen zijn gevoelig zelfs voor E. coli. De bepaling in dit verslag gepresenteerde bouwt voort op het werk van de Schneider-lab te kwantificeren in vivo fagocytose door het meten van de intensiteit van de fluorescentie van deeltjes opgeslokt door dorsale schip verbonden hemocytes.

Vergelijkbaar met de aanpak van zoogdieren systemen, Drosophila genetici aanvankelijk gebruikt genoom-brede in vitro RNAi schermen ter identificatie van genen die nodig zijn voor de cellulaire immuunrespons^{18,19,20 ,21,22,23}. Echter de ontwikkeling van de volwassen in vivo fagocytose assay ingeschakeld follow-up experimenten gemakkelijk in hele dieren, waardoor onderzoekers om te controleren of de biologische de rol van factoren geïdentificeerd in in vitro onderzoek uit te voeren. Dit was het geval met de transmembrane receptor Eater, die werd voor het eerst geïdentificeerd als een bacteriële receptor in een RNAi-scherm met behulp van S2^{24 cellen} en vervolgens later getoond te bemiddelen van Escherichia coli (E. coli), Enterococcus faecalis, en Staphylococcus aureus (S. aureus) fagocytose in volwassenen²⁵.

Onze lab gebruikt de bepaling van de in vivo fagocytose in voorwaartse genetische schermen en genoom-brede vereniging studies (met behulp van de Drosophila genetische referentie paneel (DGRP)) om nieuwe genen die fagocytose in volwassen hemocytes regelen te identificeren. Deze studie leidde tot de karakterisering van de receptoren PGRP-SC1A en PGRP-SA²⁶, de intracellulaire vesikel handel van proteïne Rab14²⁷, glutamaat vervoerder Polyphemus²⁸en RNA-bindende eiwit Fox-1²⁹.

Wij verwachten dat toekomstige schermen nemen de in vivo fagocytose kunnen leiden tot de identificatie van extra genen die belangrijk voor de cellulaire immuunrespons in Drosophila zijn. Schermen met behulp van gesequenced ingeteeldestammen, zoals de DGRP of de Drosophila synthetische bevolking Resource (DSPR), kunnen het identificeren van natuurlijke varianten op het gebied van fagocytose of hemocyte ontwikkeling. Bovendien, de techniek kon worden aangenomen bij andere diersoorten Drosophila of gebruikt voor scherm nieuwe communautaire middelen, zoals de collectie van 250 Drosophila soorten onderhouden door de nationale Drosophila soorten voorraad Center (NDSSC ) op Cornell. Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd met behulp van fluorescently-geëtiketteerden bacteriële of schimmel-muur bioparticles die commercieel beschikbaar zijn of kunnen worden uitgevoerd met behulp van een willekeurig aantal bacteriële of schimmel soorten – geboden dat de microbe spreekt fluorescente markeringen .

Protocol

1. Prepareer fluoresceïne deeltjes injectie Reconstrueren van 10 mg van verkrijgbare, warmte-gedood bacteriën deeltjes aangeduid met fluoresceïne (Zie Tabel van materialen) tot een voorraad concentratie van 10 mg/mL door 990 µL steriele 1 x PBS en 10 µL 50 mM natriumazide toe te voegen. Vortex te mengen. Verdelen in eenmalig gebruik 8 µL aliquots in 0,2 mL buizen en bewaar in een donkere kast bij 4 ° C tot het minimaliseren van de bijbehorende lichtgevoeligheid.Opmerking: Nat…

Representative Results

Een schematische voorstelling van de bepaling van de in vivo fagocytose met behulp van fluoresce¨ une-geëtiketteerden deeltjes wordt weergegeven in figuur 1A. Vliegen zijn gemonteerd ventrale zijde naar beneden op een stuk van elektrische tape en de eerste twee segmenten van de buik, waar het dorsale schip zich bevindt, is duidelijk zichtbaar (figuur 1B). Belangrijke bronnen van experimentele fout ontstaan op de injectie en de …

Discussion

Verkrijgbare, fluorescently geëtiketteerde deeltjes worden gebruikt voor het beoordelen van fagocytose in het algemeen (0,2 µm carboxylaat gemodificeerde microbolletjes) of fagocytose van microben (fluorescently-geëtiketteerden warmte – of chemisch gedode bacteriën of gist). Om te beoordelen phagosome rijping, kunnen onderzoekers selecteren deeltjes aangeduid met een pH-gevoelige kleurstof die fluoresceert als pH van neutrale tot zure, zoals in de phagolysosome afneemt. U kunt ook te onderzoeken van de e…

Materials

0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	E13231	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	E23370	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	P35361	Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	A10010	Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	S23371	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	S23372	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2851	Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Z23373	Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	Z23374	Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	Z2841	Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red	Invitrogen	Z2843	Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)