Vurdere mobilnettet immunforsvaret frukt fly, Drosophila melanogaster, bruke i Vivo fagocytose analysen

Summary

Denne protokollen beskriver i vivo fagocytose analysen voksen Drosophila melanogaster å kvantifisere phagocyte anerkjennelse og rydding av mikrobielle infeksjoner.

Abstract

I alle dyr gir medfødt immunitet en umiddelbar og robust forsvar mot et bredt spekter av patogener. Humoral og cellulær immunreaksjoner er de viktigste grenene av medfødt immunitet, og mange av faktorene som regulerer disse svarene er evolutionarily konservert mellom dyr og pattedyr. Fagocytose, den sentrale delen av mobilnettet medfødt immunitet, utføres av spesialiserte blod celler i immunsystemet. Frukt fly, Drosophila melanogaster, har dukket opp som en kraftig genetisk modell å undersøke molekylære mekanismer og fysiologiske virkningene av fagocytose i hele dyr. Her viser vi en injeksjon-basert i vivo fagocytose analysen for å kvantifisere partikkel opptak og ødeleggelse av Drosophila blodlegemer, hemocytes. Prosedyren kan forskere å kontrollere nøyaktig partikkel konsentrasjonen og dose, gjør det mulig å oppnå svært reproduserbar resultater på kort tid. Eksperimentet er kvantitative, enkel å utføre, og kan brukes til skjermen for vert faktorer som innflytelse patogen anerkjennelse, opptak og klarering.

Introduction

Medfødte immunforsvar danner den første linjen i forsvaret mot sykdomsfremkallende mikrober. Disse svarene kan være funksjonelt delt i humoral og cellulær medfødt immunitet, begge er formidlet av germline-kodet mønster anerkjennelse reseptorer (PRRs) som forstand patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPs)¹. Mange av signalveier og effektor mekanismer av medfødt immunitet er bevart i pattedyr og evertebrater som Rundormer, Caenorhabditis elegans, og frukt fly, Drosophila melanogaster². Frukt fly har dukket opp som et kraftig system å studere vert forsvar mot smittsomme mikroorganismer³. Drosophila er genetisk medgjørlig, lett og rimelig oppdratt i laboratorier, og har en kort generasjonstid. Videre utstillinger frukt fly svært effektiv forsvar mot en rekke mikrober, aktivere undersøkelse av verten immunitet mot viral, bakteriell, fungal eller parasittiske patogener.

Drosophila immunologists historisk har utnyttet frem genetisk skjermer, genomet hele RNA-mediert forstyrrelser (RNAi) screening av insekt cellelinjer, og eksisterende mutant fly stammer for å undersøke medfødt immunitet-fører til den identifikasjon og karakterisering av flere evolusjonært bevarte humoral immun trasé^4,5,6,7,8. Humoral medfødte immunforsvaret er, uten tvil, best preget immunforsvar forsvar i frukt fluer. Etter infeksjon fører humoral respons til produksjon og systemisk utgivelsen av antimikrobielle peptid (AMP) molekyler i hemolymph, blod tilsvarende i insekter. Forsterkere produseres av høyt konservert Toll og Imd signalnettverk trasé. Toll veien er homologe til pattedyr TLR/IL-1R reseptor signalering Imd veien er homologe til pattedyr Tumor nekrose faktor-alfa signalering. I Drosophila, Toll signalnettverk er indusert av gram-positive bakterier, sopp og Drosophila X virus^6,9,10 og Imd signalnettverk er indusert av gram-negative bakterier^{11 ,12}.

Cellulære immunitet, består av innkapsling, melanization og fagocytose invasiv patogener, utført av spesialiserte blodlegemer kalt hemocytes¹³. Det er tre klasser av hemocytes i frukt fly: krystall celler, lamellocytes og plasmatocytes¹³. Krystall celler, som utgjør 5% av sirkulerende hemocytes i larver, slipper proPhenoloxidase (forslag) enzymer fører til melanization av patogener og vert vev på såret nettsteder. Lamellocytes, som ikke normalt finnes i friske befruktede egg eller larver, er tilhenger celler som innkapsler fremmedlegemer. Disse cellene er indusert pupariation eller når parasitizing veps egg er avsatt i larver. Phagocytic plasmatocytes, som utgjør 95% av sirkulerende hemocytes i larver og alle gjenværende hemocytes i voksne, spille en rolle i vev remodeling under utvikling og, spesielt, fungere som den viktigste effektor cellen i Drosophila cellulære immunitet.

Fagocytose en umiddelbar og avgjørende linje av medfødte immunforsvaret forsvar; mikrober som bryter vert epithelial barrieren er raskt oppslukt og eliminert phagocytic blodceller (For en omfattende gjennomgang av cellebiologi på fagocytose se referanse ¹⁴). Denne prosessen er igangsatt når germline-kodet mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) på hemocytes gjenkjenne patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPs) av mikrober. Når bundet til sine mål, starte PRRs signalnettverk cascades som fører til dannelsen av eukaryotene gjennom begrepsordbok cytoskjelett remodeling. Eukaryotene omgir mikrobe, som senere oppslukt og internalisert i en begynnende organeller, phagosome. Mikrober er ødelagt som phagosome gjennomgår prosessen med phagosome modning når phagosome smugles mot indre av hemocyte og Forsurer gjennom en rekke interaksjon med lysosomer. I vitro og celle har biologi studier i primære pattedyrceller vært medvirkende i identifisere og karakteriserer faktorer som regulerer fagocytose, som pattedyr Fc-gamma reseptor og C3b reseptorer^15,16. Likevel muligheten til å kjøre store skjermer eller i vivo studier er begrenset i pattedyr systemer.

Her presenterer vi en i vivo analysen for fagocytose i voksen frukt fluer, som er basert på en prosedyre først introdusert av laboratoriet av David Schneider i 2000¹⁷. Schneider laboratoriet viste at fastsittende hemocytes gruppert langs abdominal dorsal fartøyet lett phagocytose polystyren perler og bakterier. For å visualisere fagocytose, fluer er injisert med fluorescently merket partikler (som E. coli merket med fluorescein isothiocyanate (E. coli –FITC)), ruges i 30 minutter for å gi hemocytes tid til å sluke partikler, og deretter injisert med trypan blå som slukker fluorescens partikler ikke phagocytosed under inkubasjonstiden. Fly dorsal fartøy er da fotografert med en invertert fluorescerende mikroskop. Denne banebrytende papir, bruker et relativt enkelt eksperiment, viste at hemocytes phagocytose bakterier og latex perler, som bakteriell fagocytose kan bli hemmet av pre sprøytebruk flyr med latex perler, og som flyr uten både cellulære og humorale immunreaksjoner er utsatt til E. coli. Analysen presentert i denne rapporten bygger på arbeidet til Schneider lab å kvantifisere i vivo fagocytose ved å måle fluorescens intensiteten av partikler omsluttet av dorsal fartøyet tilknyttet hemocytes.

Lik tilnærming tatt i pattedyr systemer, Drosophila Genetikere opprinnelig brukt genomet hele i vitro RNAi skjermer for å identifisere tilblivelse kreves for mobilnettet immunforsvaret^{18,19,20 ,21,22,23}. Men aktivert utviklingen av voksen i vivo fagocytose analysen oppfølgingseksperimenter utføres lett i hele dyr, slik at forskere til å kontrollere biologiske faktorer i in vitro studier rollen. Slik var tilfellet med transmembrane reseptoren Eater, som ble først identifisert som en bakteriell reseptor i en RNAi skjermen bruker S2 celler²⁴ og deretter vist å megle Escherichia coli (E. coli), Enterococcus faecalis, og gule stafylokokker (S. aureus) fagocytose voksne²⁵.

Våre lab ansatt i vivo fagocytose analysen i fremover genetisk skjermer og genom hele association studier (med Drosophila genetisk referanse Panel (DGRP)) til å identifisere romanen gener som regulerer fagocytose i voksen hemocytes. Disse studiene førte til karakterisering receptors PGRP-SC1A og PGRP-SA²⁶, intracellulær vesicle menneskehandel protein Rab14²⁷, glutamat transporter Polyfemos²⁸og RNA-bindende protein Fox-1²⁹.

Vi forventer at fremtidige skjermer innlemme det i vivo fagocytose kan føre til identifisering av flere gener som er viktige for mobilnettet immunforsvaret i Drosophila. Skjermer med fullt sekvensielt innavlet linjer, som DGRP eller Drosophila syntetiske befolkningen ressurs (DSPR), kan identifisere naturlig varianter påvirker fagocytose eller hemocyte utvikling. Videre kan teknikken være vedtatt i andre arter av Drosophila eller brukes til skjermen nye-ressurser, som samlingen av 250 Drosophila arter vedlikeholdes av den nasjonale Drosophila arter lager Center (NDSSC ) ved Cornell. Disse eksperimentene kan utføres ved hjelp av fluorescently-merket bakterielle eller sopp-vegg bioparticles som er tilgjengelig kommersielt eller kan utføres ved hjelp av en rekke bakterier og sopp arter-forutsatt at mikrobe uttrykker fluorescerende markører .

Protocol

1. klargjør Fluorescein partikler for injeksjon Rekonstituer 10 mg av kommersielt tilgjengelig, varme-drepte bakterier partikler merket med fluorescein (se Tabell of Materials) til en lager konsentrasjon av 10 mg/mL ved å legge 990 µL sterilt 1 x PBS og 10 µL 50 mM Natriumazid. Vortex å blande. Del i engangs 8 µL dele i 0,2 mL rør og lagre i en mørk boks 4 ° C å minimere tilknyttet lysfølsomhet.Merk: Natriumazid konserveringsmiddel er valgfri og kan utelates hvis 10 mg/mL…

Representative Results

En skjematisk av i vivo fagocytose analysen ved hjelp av fluorescein-merket partikler vises i figur 1A. Fluene er montert ventral side ned på et stykke elektriske tape og de to første delene av magen, der dorsal fartøyet ligger, er synlig (figur 1B). Sentrale kilder for eksperimentell feil oppstå ved injeksjon og tenkelig trinnene av fremgangsmåten (figur 1 c). Bruker samme p for å injisere fle…

Discussion

Kommersielt tilgjengelig, fluorescently merket, brukes til å vurdere fagocytose generelt (0,2 µm carboxylate endret mikrosfærer) eller fagocytose av mikrober (fluorescently merket varme – eller kjemisk drepte bakterier eller gjær). For å vurdere phagosome modning, kan forskere velge partikler merket med en pH-sensitive fargestoff som fluoresces når pH reduseres fra nøytrale til surt, som i phagolysosome. Også for å undersøke de første stegene fagocytose, patogen anerkjennelse og opptak, bør forsk…

Materials

0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	E13231	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	E23370	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	P35361	Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	A10010	Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	S23371	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	S23372	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2851	Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Z23373	Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	Z23374	Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	Z2841	Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red	Invitrogen	Z2843	Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)