Подготовка к нейтрали-заряженной, рН-отзывчивой полимерных наночастиц для Цитосаолийской Сирны Доставка
Summary
Представлены методы подготовки и характеристики физико-химических свойств и биоактивности нейтрали-заряженных, рН-отзывчивых наночастиц СиРНА. Обсуждаются критерии успешного, например, размер, морфология, поверхностная зарядка, нагрузка на иРНК и глушителей генов.
Abstract
Успех СиРНА как целевой молекулярной медицины зависит от его эффективной цитозололиной доставки в клетки в тканях патологии. Клинический успех для лечения ранее не «безнаркоспособных» целевых показателей печеночной болезни с помощью Сирны был достигнут. Однако эффективная поставка опухоли СиРНА обусловливает необходимость в дополнительных фармакокинетических соображениях проектирования, включая длительное время циркуляции, уклонение от очистки органов (например, печень и почки), а так же проникновение и удержание опухоли. Здесь мы описываем подготовку и экстракорпоральное физикохимическое/биологическое описание полимерных наночастиц, предназначенных для эффективной доставки СиРНА, в частности, к не печеночной ткани, такой как опухоли. Наночастицы СиРНА подготавлиются электростатической комплексообразованием СиРНА и полиолмера поли (этилен гликоль-б-[2-(диметиламин) этилметакриловой-Co-Butyl метакрилат]) (ПЭГ-дБ) для формирования polyion комплексов ( полиплексы), где СиРНА изолированный внутри полиплекса ядра и ПЭГ образует гидрофильные, нейтрально заряженных короны. Кроме того, блок DB становится мембранно-литической, как пузырьки эндолизомального пути окислить (< рН 6,8), вызывая эндосомальный побег и цитозололическую доставку СиРНА. Описаны методы для характеристики физикохимических характеристик наночастиц СиРНА, таких как размер, поверхностная зарядка, морфология частиц и нагрузка на СиРНА. Биоактивность наночастиц СиРНА измеряется с помощью люциферазы в качестве типового гена в быстром и высокой пропускной способности глушителей анализа гена. Проекты, которые проходят эти первоначальные тесты (например, полиплексы на основе ПЭГ-БД), считаются подходящими для перевода на доклинические исследования животных, оценивающих доставку СиРНА в опухоли или другие места патологии.
Introduction
Потому что сирнас ингибирует перевод белков из мРНК последовательностей, они теоретически могут быть использованы для наркотиков всех известных патологий1,2,3,4,5. Тем не менее, использование СиРНА в медицине ограничено всесторонне бедным Фармакокинетический профиль молекул СиРНА6,7. При введении внутривенно, сирнас быстро очищается через почки и/или деградирует нуклеазы8,9. Из-за большого размера и отрицательного заряда, СиРНА не может войти в клетки или избежать эндолизомального пути для доступа к РНК-индуцированной комплекс глушителей (RISC), который находится в цитозоль10,11,12, 13-ое. Таким образом, были предприняты активные усилия по разработке и внедрению стратегий доставки СиРНА14. Эти усилия в значительной степени сосредоточены на развитии липидных и полимеров на основе наночастиц, которые пакет СиРНА, защитить его от очистки и деградации в естественных условиях, и инициировать поглощение клеток и эндосомальных бежать через ионируемых, катионических аминов групп. Многие доклинические успехи были зарегистрированы и в последнее время, первый клинический успех был сообщены для нано, основанных на печени, на основе Рсрнк доставки для лечения наследственных транстимотина-опосредованного (Хаттр) амилоидоз15.
Есть много вызывающих рак генов, которые в настоящее время “undruggable” по традиционной фармакологии (например, малые молекулы наркотиков), мотивируя дизайн полимерных наночастиц СиРНА (Si-НПВ) для лечения рака16. Тем не менее, есть отдельный набор параметров дизайна, которые должны быть рассмотрены для не-печеночной СиРНА доставки. Система доставки должна оградить катионический заряд полиплекса, который вызывает агглютинации в рамках системного обращения17,18,19. Для доставки опухоли, в частности, Si-НП стабильности имеет важное значение для наделять длительный тираж и, следовательно, увеличение накопления в рамках опухоли с помощью расширенной проницаемости и удержания (ОРЭД) эффект20,21. Кроме того, контроль над размером Si-НП имеет важное значение, так как только наночастицы примерно 20-200 Нм диаметром в размер плечо ЭПР22, и меньше Si-ЯИЭ (~ 20-50 Нм диаметром) экспонат Улучшение проникновения опухоли более крупных размеров наночастиц и микрочастицы23.
Для решения этих дополнительных проектных ограничений на системную поставку опухоли в СиРНА после внутривенного введения, нейтрально заряженных, рН-отзывчивый Si-НПВ были разработаны (рис. 1)24. Эти Si-НПВ являются PEGylated, или совсем недавно, Zвиттерионионированной25, для нейтральной поверхности заряда и устойчивость к протеиновой адсорбции и опсонизации в обращении. Поскольку они не могут полагаться исключительно на катионический характер диска внутриклеточного доставки, чрезвычайно эффективным эндосомальных побег является обязательным условием для достижения мощного глушителей генов. Соответственно, ядро этих Si-НПВ состоит из высокоэндолитического ядра, которое инертно при внеклеточной рН (7,4), но которое срабатывает в коммутатор-подобный способ в подкисленные условия эндолизомального пути [pH 6,8 (ранние эндосомы)-5,0 ( лизосомы)]. Наконец, смесь катионного и гидрофобного содержания в ядре Si-ЯИЭ обеспечивают как электростатические, так и стабилизационные силы Ван-дер-Ваальса, улучшая устойчивость Si-НПВ в крови по сравнению с просто катионическим системами.
Интеграция многих функций в относительно простую конструкцию возможна с помощью обратимой цепочки переноса фрагментации (плот), контролируемой полимеризации, для производства полимеров со сложной архитектурой и точным составом. Для производства Si-ЯИЭ с нейтральным поверхностным зарядом, рН-отзывчивостью и стабильностью НП, плот используется для синтеза поли (этиленгликоль-б-[2-(диметиламин) Этилметакрилат-ко-бутил метакрилат)) (ПЭГ-дБ; Рис. 1A). ПЭГ-дБ является электростатически комплексированных с СиРНА, формирование Si-ЯИЭ с ПЭГ Корона и DB/СиРНА ядра (рис. 1b). ПЭГ образует инертный, нейтрально заряженный гидрофильный слой в Си-НП Корона. Блок DB состоит из 50:50 молярного соотношения 2-(диметиламин) этилметакрилта (DMAEMA) и бутиля метакрилат (БМА). Катионические DMAEMA электростатически комплексы отрицательно заряженные СиРНА. БМА самоассоциированные в рамках НП ядро взаимодействия ван дер Ваальса, повышение стабильности НП. Вместе, DMAEMA и БМА передавать рН-зависимых липидного билайер-lytic поведение БД полимерных блоков. При внеклеточной рН, блок DB поглощенных к Си-НП ядро и инертен для липидных билайеры. В кислотных условиях, таких, как в пределах эндосомального пути, иоментизируемая DMAEMA в блоке DB облегчает эффект протонной губки, где эндосомная буферизация приводит к осмотическим отеку и разрыву26. Дополнительно, гидрофобные МДА, в пределах блока DB активно интегрируются в и Lyse липидные билайеры, в результате мощного эндосомолиза. Таким образом, СиРНА комплексируется с ПЭГ-БД для формирования Si-НПВ, которые нейтрально заряженных и очень стабильной при внеклеточной рН, но которые нарушают липидные билайеры на кислотных рН, обеспечивая цитозололические доставки полезной нагрузки СиРНА.
Здесь описаны экспериментальные процедуры по производству Si-НПВ от ПЭГ-БД. Представлены и обсуждаются методы, характеризующие Физикохимические параметры и биоактивность Si-НПВ. Чтобы быстро оценить биоактивность Si-НП, Люцифераза используется в качестве типового гена для исследований нокдауна. Светлячок люциферазы является белок, ответственный за “свечение” светлячков27. Соответственно, клетки млекопитающих, трансфецированных в гене люцифязы Светлячок производят светящихся “свечение”, которые могут быть захвачены с помощью лютометр для количественной оценки уровней люциферазы выражения. Здесь мы используем люциферазу для оценки биологической активности Si-НПВ, предоставляя СиРНА против люциферазы и количественного соответствующего сокращения биолюминесценции в Люцифферасе-экспрессируя клетки по сравнению с клетками, которые получают зашифрованный СиРНА.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанные здесь Si-НПВ формируются электростатической ассоциацией анионических СиРНА и катионических полимеров в полионные комплексы (полиплексы). Электростатическое комплексирование СиРНА и катионический DB полимеров ПЭГ-DB способствует смешиванию при низком РН (4,0). При pH 4,0, DMAEMA очень…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят доктора Крейга Дюваля и Ребекку Кук за доступ к данным и лабораторным ресурсам для проведения этих исследований. Авторы благодарят институт по наноразмерным наукам и разработкам (VINSE) Вандербильта для доступа к инструментам DLS и ТЕА (EPS 1004083). Авторы благодарят Национальный научный фонд за поддержку программы стипендий для выпускников исследовательских программ (ННФ # 1445197). Авторы благодарят национальные институты здравоохранения за финансовую поддержку (низ R01 EB019409). Авторы благодарят программу медицинского исследования Министерства обороны США, направленную на финансовую поддержку (ДМО OR130302).
Materials
| 0.45 mm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
- Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244 (2002).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).
- Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
- Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
- Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
- Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
- Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).
- Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
- Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
- Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
- Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).
- Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
- Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).
- Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
- Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
- Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
- Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
- de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
- Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
- Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).
- Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
- Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
- Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. 암 연구학. 78 (7), 1845-1858 (2018).
- Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
- Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).
- Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).
- Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
- Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
- Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).
