Préparation de nanoparticules polymériques à charge neutralement et sensibles au pH pour la livraison de siRNA cytosoliques
Summary
On présente des méthodes pour préparer et caractériser les propriétés physico-chimiques et la bioactivité des nanoparticules de siRNA à charge neutrale et à pH réactif. On discute des critères pour les nanomédites siRNA réussis tels que la taille, la morphologie, la charge superficielle, le chargement de siRNA et le silençage génique.
Abstract
Le succès de la siRNA en tant que médecine moléculaire ciblée dépend de sa délivrance efficace de cytosoliques aux cellules dans le tissu de la pathologie. Le succès clinique pour le traitement des cibles de maladies hépatiques précédemment «non-droguables» avec siRNA a été atteint. Cependant, la livraison efficace de siRNA tumoral nécessite des considérations de conception pharmacocinétique supplémentaires, y compris le temps de longue circulation, l’évasion des organes de clairance (par exemple, le foie et les reins), et la pénétration et la rétention des tumeurs. Ici, nous décrivons la préparation et la caractérisation physicochimique/biologique in vitro des nanoparticules polymériques conçues pour une administration efficace de siRNA, en particulier pour les tissus non hépatiques tels que les tumeurs. Les nanoparticules de siRNA sont préparées par complexation électrostatique de siRNA et le poly copolymère dibloc (éthylène glycol-b-[2-(diméthylamino) éthyl méthacrylate-co-butyl méthacrylate]) (PEG-dB) pour former des complexes polyioniques ( polyplexes) où le siRNA est séquestré dans le noyau Polyplex et le PEG forme une couronne hydrophile à charge neutralement. De plus, le bloc DB devient membranaire comme vésicules de la voie endolysosomale acidifiante (< pH 6,8), déclenchant l’évasion endosomique et la délivrance cytosolique de siRNA. On décrit les méthodes permettant de caractériser les caractéristiques physico-chimiques des nanoparticules de siRNA telles que la taille, la charge superficielle, la morphologie des particules et le chargement de siRNA. La bioactivité des nanoparticules de siRNA est mesurée à l’aide de la luciférase comme gène modèle dans un test de silençage génique rapide et à haut débit. Les conceptions qui passent ces tests initiaux (tels que les polyplexes à base de PEG-DB) sont jugées appropriées pour la traduction à des études précliniques d’animaux évaluant la livraison du siRNA aux tumeurs ou à d’autres sites de pathologie.
Introduction
Parce que les siRNAs inhibent la traduction des protéines des séquences d’ARNm, ils peuvent théoriquement être utilisés pour le médicament toutes les pathologies connues1,2,3,4,5. Cependant, l’utilisation de siRNA en médecine est limitée par le profil pharmacocinétique globalement médiocre des molécules de siRNA6,7. Lorsqu’elles sont injectées par voie intraveineuse, les siRNAs sont rapidement déblayés par les reins et/ou dégradés par les nucléases8,9. En raison de sa grande taille et de sa charge négative, siRNA ne peut pas pénétrer dans les cellules ou échapper à la voie endolysosomale pour accéder au complexe de silençage induit par l’ARN (RISC) qui réside dans le cytosol10,11,12, le 13. Ainsi, des efforts considérables ont porté sur la conception et la mise en œuvre des stratégies de livraison du siRNA14. Cet effort s’est largement concentré sur le développement de nanoparticules à base de lipides et de polymères qui emballez le siRNA, le protègent contre le dégagement et la dégradation in vivo, et initient l’absorption cellulaire et l’évasion endosomique par des groupes ionisables et cationiques d’amine. De nombreux succès précliniques ont été rapportés et, plus récemment, le premier succès clinique a été rapporté pour l’administration de siRNA hépatiques à base de nanoparticles pour traiter l’amylose à médiation transthyrétine héréditaire (hATTR)15.
Il y a beaucoup de gènes causant le cancer qui sont actuellement «undruggable» par la pharmacologie conventionnelle (c.-à-d. les médicaments de petite molécule), motivant la conception des nanoparticules de siRNA polymériques (si-NPs) pour traiter le cancer16. Cependant, il existe un ensemble distinct de paramètres de conception qui doivent être pris en compte pour la livraison de siRNA non hépatique. Le système de livraison doit protéger la charge cationique du Polyplex qui provoque une agglutination dans la circulation systémique17,18,19. Pour la délivrance de tumeurs, plus précisément, la stabilité du si-NP est essentielle pour doter la longue circulation et donc l’accumulation accrue dans les tumeurs par l’effet de perméabilité et de rétention améliorée (EPR)20,21. En outre, le contrôle de la taille de si-NP est essentiel puisque seulement des nanoparticules approximativement 20 – 200 nm de diamètre dans l’effet de levier de taille EPR22, et les plus petits Si-NPS (~ 20 – 50 nm de diamètre) montrent une pénétration tumorale améliorée sur des nanoparticules de plus grande taille et microparticules23.
Pour répondre à ces contraintes de conception supplémentaires pour la délivrance de tumeurs systémiques du siRNA après administration intraveineuse, des si-NPs sensibles au pH, à charge neutralement, ont été développés (figure 1)24. Ces si-NPs sont PEGylated, ou plus récemment, Zwitterionated25, pour la charge de surface neutre et la résistance à l’adsorption des protéines et l’opsonisation en circulation. Puisqu’ils ne peuvent pas compter uniquement sur le caractère cationique pour conduire l’accouchement intracellulaire, une évasion endosomique extrêmement efficace est indispensable pour obtenir un silencieux génique puissant. En conséquence, le noyau de ces si-NPs est composé d’un noyau hautement endosomolytique qui est inerte au pH extracellulaire (7,4), mais qui est déclenché de manière semblable aux commutateurs dans les conditions acidifiées de la voie endolysosomale [pH 6,8 (endosomes précoces) – 5,0 ( lysosomes)]. Enfin, un mélange de contenu cationique et hydrophobe dans le noyau du si-NPs fournit des forces de stabilisation électrostatique et van der Waals, améliorant la stabilité du si-NPs dans le sang par rapport aux systèmes simplement cationiques.
L’intégration de nombreuses fonctions dans une conception relativement simple est possible en utilisant réversible addition-fragmentation chaîne transfert (RAFT) contrôlée de polymérisation pour produire des polymères avec une architecture complexe et une composition précise. Pour produire du si-NPs avec une charge de surface neutre, une réactivité au pH et une stabilité NP, RAFT est utilisé pour synthétiser du poly (éthylène glycol-b-[2-(diméthylamino) éthyle méthacrylate de méthacrylate deco-butyle]) (PEG-DB; Figure 1a). Le PEG-DB est complexé par électrostatiquement avec le siRNA, formant le si-NPs avec une Corona de PEG et un noyau de DB/siRNA (figure 1b). Le PEG forme une couche hydrophile inerte et neutralement chargée sur la Couronne si-NP. Le bloc de DB se compose d’un ratio molaire de 50:50 de 2-(diméthylamino) éthyl méthacrylate (DMAEMA) et de méthacrylate de butyle (BMA). DMAEMA cationique complexe électrostatiquement des siRNA à charge négative. Les auto-associés BMA dans le noyau NP par les interactions de van der Waals, augmentant la stabilité de NP. Ensemble, le DMAEMA et le BMA transmettent un comportement lytique lipidique dépendant du pH au bloc polymère DB. Au pH extracellulaire, le bloc de DB est séquestré au noyau si-NP et est inerte aux bilayers lipidiques. Dans des conditions acides, telles que celles de la voie endolysosomale, le DMAEMA ionisable dans le bloc de DB facilite l’effet de l’éponge de proton, où le tampon endosomique conduit à un gonflement osmotique et à une rupture26. En outre, les fractions hydrophobes de BMA dans le bloc de DB s’intègrent activement et lyse les bicouches lipidiques, entraînant une endosomolyse puissante. Ainsi, siRNA est complexé avec PEG-DB pour former des Si-NPS qui sont neutralement chargés et très stables au pH extracellulaire, mais qui perturbent les bicouches lipidiques à pH acide, assurant la livraison cytosolique de la charge utile siRNA.
Dans les présentes sont décrits les procédures expérimentales pour produire si-NPs de PEG-DB. Les méthodes permettant de caractériser les paramètres physicochimiques et la bioactivité des si-NPs sont présentées et discutées. Afin d’évaluer rapidement la bioactivité du si-NP, la luciférase est utilisée comme gène modèle pour les études de renversement. Luciferase Firefly est la protéine responsable de la «lueur» des lucioles27. En conséquence, les cellules de mammifères transfectées avec le gène luciférase Firefly produisent une «lueur» bioluminescente qui peut être capturée à l’aide d’un luminomètre pour quantifier les niveaux d’expression de la luciférase. Ici, nous utilisons Luciferase pour évaluer la bioactivité de si-NPs en livrant siRNA contre luciferase et en quantifiant la réduction correspondante de la bioluminescence dans les cellules exprimant la luciférase par rapport aux cellules qui reçoivent un siRNA brouillé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les si-NPs décrits ici sont formés par l’association électrostatique de siRNA anionique et de polymères cationiques en complexes POLYIONS (polyplexes). Le complexage électrostatique du siRNA et du bloc de DB cationique des polymères PEG-DB est facilité par un mélange à faible pH (4,0). À pH 4,0, le DMAEMA est fortement protoné, et par conséquent le bloc de DB est fortement chargé. Cela garantit que les polymères se dissolvent comme unimères en solution par opposition à former des micelles et que DB comp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants aux Drs Craig Duvall et Rebecca Cook d’avoir accès aux données et aux ressources de laboratoire pour mener cette recherche. Les auteurs sont reconnaissants à l’Institut Vanderbilt pour la science et l’ingénierie nanométrique (VINSE) d’avoir accès aux instruments DLS et TEM (NSF EPS 1004083). Les auteurs sont reconnaissants à la National Science Foundation de soutenir le programme de bourses de recherche des diplômés (NSF # 1445197). Les auteurs sont reconnaissants aux instituts nationaux de la santé pour leur soutien financier (NIH R01 EB019409). Les auteurs sont reconnaissants au ministère de la défense du programme de recherche médicale dirigée par le Congrès pour le soutien financier (DOD CDMRP OR130302).
Materials
| 0.45 mm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
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