Vorbereitung von Neutral-aufgeladenen, pH-responsiven polymischen Nanopartikeln für zytosolische siRNA Delivery

Summary

Es werden Methoden zur Vorbereitung und Charakterisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften und der Bioaktivität von neutral aufgeladenen, pH-responsiven siRNA-Nanopartikeln vorgestellt. Es werden Kriterien für erfolgreiche siRNA-Nanomedizine wie Größe, Morphologie, Oberflächenaufladung, siRNA-Ladung und Gen-Schweigung diskutiert.

Abstract

Der Erfolg von siRNA als zielgerichteter molekularer Medizin hängt von der effizienten zytosolischen Zufuhr an Zellen im Gewebe der Pathologie ab. Der klinische Erfolg bei der Behandlung von bisher “untrüglichen” Lebererkrankungen mit siRNA wurde erzielt. Eine effiziente TumorsiRNA-Zufuhr erfordert jedoch zusätzliche pharmakokinetische Gestaltungsüberlegungen, darunter lange Umlaufzeiten, Ausweichorgane (z.B . Leber und Nieren) sowie Tumordurchdringung und-bindung. Hier beschreiben wir die Zubereitung und in vitro physicochemical/biologische Charakterisierung von polymerischen Nanopartikeln, die für eine effiziente SiRNA-Lieferung, insbesondere für nicht-epatische Gewebe wie Tumoren, entwickelt wurden. Die siRNA-Nanopartikel werden durch elektrostatische Komplexe von siRNA und dem DBlock-Copolymer-Poly (Ethylen-Glykol-b-[2-(Dimethylamino) Meylmethacrylate-Co-Butylmethacrylat]) (PEG-DB) zu Polyionen hergestellt. In der Lage, sich in der Lage zu befinden, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage zu sein. Darüber hinaus wird der DB-Block als Vesikel des endolysosomalen Pfades (< pH 6.8), was endosomale Escape-und zytosolische Lieferung von siRNA auslöst. Es werden Methoden beschrieben, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften von siRNA-Nanopartikeln wie Größe, Oberflächenaufladung, Partikelmorphologie und siRNA-Belastung zu charakterisieren. Die Bioaktivität von siRNA-Nanopartikeln wird mittels Luciferase als Modell-Gen in einem schnellen und hochdurchgehenden Gen-Schweigungsanfall gemessen. Entwürfe, die diese ersten Tests bestehen (wie PEG-DB-basierte Polyplexe), gelten als geeignet für die Übersetzung in präklinische Tierstudien, die die Lieferung von siRNA an Tumoren oder andere Orte der Pathologie bewerten.

Introduction

Da siRNAs die Übersetzung von Proteinen aus mRNA-Sequenzen hemmen, können sie theoretisch verwendet werden, um alle bekannten Pathologien^{1,2, 3,4,}5^zumedikamentös zu machen. Der Einsatz von siRNA in der Medizin wird jedoch durch das umfassend schlechte pharmakokinetische Profil von siRNA-Molekülen 6^,7begrenzt. Wenn sie intravenös injiziert werden, werden siRNAs schnell durch die Nieren und/oder durch Nukleasen8,9^abgebaut. Aufgrund seiner großen Größe und negativen Ladung kann siRNA^nichtin die Zellen eindringen oder dem endolysosomalen Weg entkommen, um auf den RNA-induzierten Stillstandskomplex (RISC) zuzugreifen, der im Cytosol 10^{,11, 12, 13. November} So konzentriert sich der umfangreiche Aufwand auf die Konzeption und Umsetzung von siRNA-Lieferstrategien 14. Diese Bemühungen konzentrierten sich weitgehend auf die Entwicklung von lipid-und polymerbasierten Nanopartikeln, die siRNA verpacken, vor Räumung und Degradierung in vivo schützen und durch ionisierbare, kationelle Aminengruppen eine zelluläre Aufnahme und endosomale Flucht auslösen. Es wurden viele präklinische Erfolge gemeldet und zuletzt wurde der erste klinische Erfolg für die nanopartikel-basierte Leberlieferungen zur Behandlung der erblichen Transthyrein-vermittelten (hATTR) Amyloidose 15 gemeldet.

Es gibt viele krebserregende Gene, die derzeit von der konventionellen Pharmakologie “nicht rugdfähig” sind (z.B. kleine Molekülmedikamente), die das Design von polymerischen siRNA-Nanopartikeln (si-NPs) zur Behandlung von Krebs^{16 motivieren}. Es gibt jedoch einen separaten Satz von Konstruktionsparametern, die für die nicht-hepatische siRNA-Lieferung berücksichtigt werden müssen. Das Liefersystem muss die kationische Ladung des Polyplex abschirmen, die eine Agglutination innerhalb der systemischen Zirkulation 17^,18,19verursacht. Für die Tumorzufuhr ist insbesondere die si-NP Stabilität unerlässlich, um eine lange Zirkulation und damit eine erhöhte Akkumulation innerhalb von Tumoren durch die verbesserte Durchlässigkeit undRetentionseffekt (EPR) 20^,21zu erzeugen. Darüber hinaus ist die Kontrolle über die Größe von si-NP unerlässlich, da nur Nanopartikel mit einer Größe von etwa 20 – 200 nm Durchmesser EPR²²und kleinere si-NPs (~ 20 – 50 nm Durchmesser) eine verbesserte Tumordurchdringung gegenüber größeren Nanopartikeln aufweisen und Mikropartikel²³.

Um diesen zusätzlichen Konstruktionseinschränkungen für die systemische Tumorzustellung von siRNA nach intravenöser Verabreichung gerecht zu werden, wurden neutral aufgeladene, pH-reaktionsfähige si-NPs entwickelt (Abbildung 1)²⁴. Diese si-NPs sind PEGylatierte^,oder zuletzt Zwitterionierte 25, für neutrale Oberflächenaufladung und Resistenz gegen Proteinadsorption und Opsonisierung im Umlauf. Da sie sich nicht allein auf den kationischen Charakter verlassen können, um die intrazelluläre Lieferung voranzutreiben, ist ein äußerst effizientes endosomales Escape-Escape-Gebot, um eine starke Genverstallung zu erreichen. Dementsprechend besteht der Kern dieser si-NPs aus einem hochendosomolytischen Kern, der bei extrazellulärem pH-Wert (7,4) inert ist, aber in schalterlicher Weise unter den sauren Bedingungen des endolysosomalen Weges [pH 6.8 (frühe Endosomen) – 5.0 ausgelöst wird ( Lysosomen)]. Schließlich sorgt eine Mischung aus kationischem und hydrophobischem Gehalt im Kern der si-NPs für elektrostatische und van der Waals-Stabilisierungskräfte, die die Stabilität der si-NPs im Blut im Vergleich zu rein kationischen Systemen verbessern.

Die Integration vieler Funktionen in ein relativ einfaches Design ist durch die reversible Addition-Fragmentierungskette Transfer (RAFT) zur Herstellung von Polymeren mit komplexer Architektur und präziser Komposition möglich. Zur Herstellung von Si-NPs mit neutraler Oberflächenaufladung, pH-Reaktionsfähigkeit und NP-Stabilität wird RAFT verwendet, um Poly (Ethylen-Glykol-b–[2-(Dimethylamino) Ethylmethacrylate–Butylmethacrylat] zu synthetisieren. Abbildung 1A). PEG-DB ist elektrostatisch mit siRNA vervollbbar und bildet si-NPs mit einem PEG-Korona und DB/siRNA-Kern (Abbildung 1B). PEG bildet eine inerte, neutral geladene hydrophile Schicht auf der si-NP Corona. Der DB-Block besteht aus einem 50:50-molaren Verhältnis von 2-(Dimethylamino) Ethylmethacrylat (DMAEMA) und Butylmethacrylat (BMA). Die ationische DMAEMA umsetzt elektrostatisch die negativ geladene siRNA. BMA Selbst-assoziierte innerhalb der NP-Kern von van der Waals Interaktionen, die Erhöhung der NP-Stabilität. Gemeinsam vermitteln DMAEMA und BMA pH-abhängiges Lipidbilayer-lytisches Verhalten an den DB-Polymerblock. Bei extrazellulärem pH wird der DB-Block an den si-NP-Kern geklebt und ist inert auf Lipidbilayers. Unter sauren Bedingungen, wie zum Beispiel innerhalb des Endolysosomalpfads, erleichtert die ionisierbare DMAEMA innerhalb des DB-Blocks den Protonenschwamm-Effekt, bei dem die endosomale Pufferung^zuosmotischer Schwellung und Bruch 26 führt. Darüber hinaus integrieren sich hydrophobe BMA-Moieanlagen innerhalb des DB-Blocks aktiv in und lysen Lipidbilayers, was zu einer starken Endosomolyse führt. So wird siRNA mit PEG-DB zu si-NPs Komplexiert, die neutral aufgeladen und bei extrazellulärem pH-Wert hochstabil sind, aber die Lipidbilayer bei saurem pH-Wert stören und so eine zytosolische Lieferung der siRNA-Nutzlast gewährleisten.

Hierin werden die experimentellen Verfahren beschrieben, um si-NPs von PEG-DB zu produzieren. Es werden Methoden zur Charakterisierung der physikalisch-chemischen Parameter und der Bioaktivität von si-NPs vorgestellt und diskutiert. Um die si-NP-Bioaktivität schnell zu bewerten, wird Luciferase als Modell-Gen für Knockdown-Studien eingesetzt. Firefly Luciferase ist das Protein, das für das “Glühen” der Glühwürmchen 27 verantwortlich ist. Entsprechend erzeugen Säugetierzellen, die mit dem firefly luciferase-Gen transferiert werden, ein biolumineszierendes “Glühen”, das mit einem Leuchtometer erfasst werden kann, um die Werte der Luciferase-Expression zu quantifizieren. Hier verwenden wir Luciferase, um die Bioaktivität von si-NPs zu bewerten, indem wir siRNA gegen Luciferase liefern und die entsprechende Reduktion der Biolumineszenz in Luziferase-Ausdruckszellen im Vergleich zu Zellen quantifizieren, die eine Rührei siRNA erhalten.

Protocol

1. Vorbereitung und Charakterisierung von si-NPs si-NP Vorbereitung Polymere in 10 mM-Zitronensäure-Puffer (pH 4.0) bei 3,33 mg/mL auflösen. Polymer kann zunächst bei 10x Konzentration in Ethanol aufgelöst werden, um die Auflösung zu gewährleisten.NOTE: Polymer kann in niedrigeren Konzentrationen aufgelöst werden, aber der Einsatz in Konzentrationen über 3,33 mg/mL kann eine homogene NP-Bildung verhindern. Fügen Sie siRNA (50 μM in diH2 O)hinzu, um N+:P<sup…

Representative Results

Einige wesentliche Merkmale der effektiven si-NPs für die In-vivo siRNA-Lieferung sind die richtige Größe (~ 20 – 200 nm Durchmesser), siRNA-Verpackungen und Gen-Schweigenden Bioaktivität. Obwohl es sich hierbei nicht um eine erschöpfende Liste handelt (wie in der Diskussion angesprochen), sollten diese grundlegenden Merkmale bestätigt werden, bevor eine weitere Prüfung einer Formulierung in Erwägung gezogen wird. <str…

Discussion

Die hier beschriebenen si-NPs werden durch die elektrostatische Assoziation von anionischen siRNA und kationischen Polymeren zu Polyionenkomplexen (Polyplexe) gebildet. Die elektrostatische Verkomplexung von siRNA und dem kationischen DB-Block von PEG-DB-Polymeren wird durch das Mischen mit niedrigem pH-Wert (4.0) erleichtert. Bei pH 4.0 ist DMAEMA hoch protoniert, und damit ist der DB-Block hoch aufgeladen. Damit wird sichergestellt, dass sich die Polymere als Eindringlinge in der Lösung auflösen und keine Mikellen bi…

Materials

0.45 mm pore-size syringe filters	Thermo Fisher Scientific	F25133	17 mm diameter, PTFE membrane
0-14 pH test strips	Millipore Sigma	P4786
10x TAE buffer	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	AM9869
6-7.7 pH test strips	Millipore Sigma	P3536
96-well black walled plates	Corning	3603	Tissue-culture treated
Agarose Powder	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	16500
Citric acid monohydrate	Millipore Sigma	C1909
dibasic sodium phosphate dihydrate	Millipore Sigma	71643
D-luciferin	Thermo Fisher Scientific	88294	Monopotassium Salt
DMEM	Gibco	11995065	High glucose and pyruvate
Ethanol	Millipore Sigma	459836
ethidium bromide	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	15585011
FBS	Gibco	26140079
loading dye	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	R0611
Luciferase siRNA	IDT	N/A	Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells	GenTarget Inc	SC059-Bsd	Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity
monobasic sodium phosphate monohydrate	Millipore Sigma	S9638
Scarmbled siRNA	IDT	N/A	Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases
square polystyrene cuvettes	Fisher Scientific	14-955-129	4.5 mL capacity
TEM grids	Ted Pella, Inc.	1GC50	PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper
Trisodium citrate dihydrate	Millipore Sigma	S1804
uranyl acetate	Polysciences, Inc.	21447-25