사이토 솔 릭 siRNA 전달을 위한 중성 충전, pH 반응 형 고분자 나노 입자의 제조

Summary

화학적 성질을 준비 및 특성화 하는 방법 및 중성 충전 된, pH 반응 siRNA 나노 입자의 생물 활성이 제시 된다. 성공적인 siRNA에 대 한 기준은 크기, 형태학, 표면 전 하, siRNA 하 중 및 유전자 침묵과 같은 나노 의약품에 대해 논의 된다.

Abstract

표적으로 하는 분자 의학으로 siRNA의 성공은 병리학 조직 내 세포에 대 한 효율적인 사이토 졸 전달에 달려 있습니다. 이전 ‘ undruggable ‘ 간 질환 표적을 siRNA로 치료 하기 위한 임상 성공이 달성 되었다. 그러나 효율적인 종양 siRNA 전달은 긴 순환 시간, 틈새 장기의 회피 (예: 간과 신장) 및 종양 침투 및 유지 를 포함 하는 추가적인 약동 학적 설계 고려 사항을 필요로 합니다. 여기서, 우리는 특히 종양과 같은 비 간 조직에 효율적인 siRNA 전달을 위해 설계 된 중합체 나노 입자의 제제 및 시험관 내 물리 화학적/생물학적 특성화를 설명 한다. 상기 siRNA 나노 입자는 폴 리 이온 복합체를 형성 하는 siRNA와 디 블록 공중 합체 (dimethylamino) 에틸 메타 크 릴레이 트코뷰 틸 메타 크 릴레이 트) (PEG-db)의 정전기 적 복합체에 의해 제조 된다 ( 상기 siRNA는 폴 리 플렉스 코어 내에 금속 이온이 격리 되 고, PEG는 친수성, 중 화제의 코로나를 형성 한다. 더욱이, 상기 DB 블록은 내 상 염색체 통로의 소포가 산성화 함에 따라 막 용 해 되 고 (< pH 6.8), 내 상 염색체의 탈출 및 siRNA의 사이토 솔 릭 전달을 유발 한다. SiRNA의 물리 화학적 특성을 특성화 하는 방법으로는 크기, 표면 전 하, 입자 형태학 및 siRNA 하 중 등이 기재 되어 있다. SiRNA 나노 입자의 생물 활성은 신속 하 고 높은 처리량의 유전자 침묵 분석에서 모델 유전자로 서 루시퍼 라 제를 사용 하 여 측정 된다. 이러한 초기 테스트를 통과 한 설계 (예: PEG-DB 기반 폴 리 플렉스)는 종양 또는 병리학의 다른 사이트에 대 한 siRNA의 전달을 평가 하는 전 임상 동물 연구로의 번역에 적합 한 것으로 간주 됩니다.

Introduction

Sirnas는 mRNA 서 열에서 단백질의 번역을 억제 하기 때문에 이론적으로는 모든 알려진 병 리 제^1,2,⁴,⁵의 약물에 사용 될 수 있습니다. 그러나, 의학에서 sirna의 사용은 sirna 분자^6,7의 포괄적으로 가난한 약물 동태 학적 프로 파일에 의해 제한 된다. 정 맥 주사 시, sirnas는 뉴 클레 아 제^8,9에 의해 신장 및/또는 저하를 통해 급속히 제거 된다. 그것의 큰 크기 및 음 전 하 때문에, siRNA는 세포에 들어갈 수 없고 또는 내 생포 하는 통로를 이스케이프 하 여 사이토 솔 (¹⁰)에 상주 하는 RNA 유도 침묵 복합체 (RISC)에 접근 하 고^{, 13}. 따라서, 광범위 한 노력은 siRNA 전달 전략 (¹⁴)의 설계 및 구현에 초점을 맞추고 있다. 이러한 노력은 주로 siRNA를 패키지 하는 지질 및 폴리머 기반 나노 입자의 개발에 초점을 맞추고, 생체 내에서의 클리어런스 및 분해 로부터 보호 하 고, 이온화 가능한 양이온 성 아민 기를 통해 세포 흡수 및 내 염색체 탈출을 개시 한다. 많은 사전 임상 성공이 보고 되 고 가장 최근에는 유전 트랜스 티 레 틴 매개 (해 트) 아 밀 로이드 증¹⁵를 치료 하기 위해 나노 입자 기반 간 siRNA 전달에 대 한 첫 번째 임상 성공은 보고 되었습니다.

기존의 약리학 (즉, 소 분자 약물)에 의해 현재 “undruggable” 되는 많은 암 유발 유전자 들이 암 치료 용 고분자 siRNA 나노 입자의 설계에 동기를 부여 하 고 있다. 그러나, 비 간장 siRNA 납품을 위해 고려 되어야 하는 디자인 매개 변수의 개별적인 세트가 있습니다. 전달 시스템은 전신 순환¹⁷,^18,19내에서 응집을 야기 하는 폴 리 플렉스의 양이온 성 전 하를 차폐 한다. 종양 전달을 위해, 구체적으로, si-NP 안정성은 향상 된 투과성 및 유지 (epr) 효과를 통해 종양 내에 축적이 증가 하 고 따라서 긴 순환을 부여 하는 것이 필수적 이다^20,21. 더욱이, si-NP 크기에 대 한 제어는 약 20-200 nm 직경 크기의 나노 입자만을 레버리지로 서 필수적 이며, 보다 작은 Si-NPs (~ 20 50 nm 직경) 더 큰 크기의 나노 입자에 대 한 개선 된 종양 침투를 나타낸다 미세 입자²³.

이러한 추가적인 설계 제약을 해결 하기 위해 정 맥 내 투여에 따르는 siRNA의 전신 종양 전달을 위한, 중성-충전, pH 반응 시-NPs가 개발 되었다 (도 1)²⁴. 이러한 si-NPs는 페 길 화 된, 또는 가장 최근에는, 중성 표면 전 하 및 순환에 있는 단백질 흡착 및 오 손 화에 저항을 위한 Zwitterionated²⁵입니다. 그들은 세포내 전달을 구동 하기 위해 양이온 성 문자에 전적으로 의존 할 수 없기 때문에, 매우 효율적인 내 염색체 탈출은 강력한 유전자 침묵을 달성 하기 위한 필수적 이다. 따라서, 이러한 si-NPs의 코어는 세포 외 pH (7.4)에서 불활성 인 고 내 분 비 핵으로 구성 되어 있으 나,이는 내 리소 소 통로의 산성화 조건에서 스위치 유사 방식으로 촉발 된다 [pH 6.8 (초기 내 상 염색체) – 5.0 ( ). 마지막으로, si-NPs의 코어 내에서 양이온 성 및 소수 성 함량의 혼합물은 정전기 및 반 데르 발스 안정화 힘을 모두 제공 하 여, 단지 양이온 시스템에 비해 혈액에서의 시-NPs의 안정성을 향상 시킨다.

다양 한 기능을 비교적 단순한 설계로 통합 하는 것은 가역 적인 추가-프 래그 멘 테이 션 체인 트랜스퍼 (뗏목) 제어 중 합을 사용 하 여 복잡 한 구조와 정밀한 조성을 가진 폴리머를 생산할 수 있습니다. 중성 표면 전 하, pH 반응성 및 NP 안정성을 갖춘 dimethylamino를 생산 하기 위해 폴 리 에틸렌 글리콜을 합성 하는 데 사용 됩니다() 에틸 메타 크 릴레이 트공동부 틸 메타 크 릴레이 트)) (PEG-DB; 그림 1a). PEG-DB는 PEG 코로나 및 DB/siRNA 코어를 사용 하 여 시-NPs를 형성 하는 siRNA와 함께 정전기 적으로 복합 화 된다 (도 1b). PEG는 si-NP 코로나 상에 서 불활성의 중립-충전 된 친수성 층을 형성 한다. 상기 DB 블록은 2-dimethylamino) 에틸 메타 크 릴레이 트 (DMAEMA) 및 부 틸 메타 크 릴레이 트 (BMA)의 50:50 몰 비로 이루어진다. 양이온 DMAEMA 정전기 적으로 복합체는 음으로 충전 된 siRNA. BMA는 np 안정성을 증가 시키고 반 데르 발스 상호 작용에의 한 NP 코어 내에서의 자가 동료 이다. 함께, DMAEMA 및 BMA는 DB 폴리머 블록에 pH 의존적 지질 이중-용 해 거동을 부여 한다. 세포 외 pH에서, DB 블록은 si-NP 코어에 금속 화 되 고 지질 이중 층에 불활성 이다. 내 상 염색체 통로 내에 있는 것과 같은 산 성 조건 하에서, DB 블록 내 이온화 가능한 DMAEMA는 양성자 스폰지 효과를 용이 하 게 하 고, 내 상 염색체 완충은 삼 투 팽 윤 및 파열을 유도 한다²⁶. 추가적으로, DB 블록 내의 소수 성 BMA 모이 어 티는 지질 이중 층으로 활발 하 게 통합 되 고, 강력한 내 혈관 분해를 초래 한다. 따라서, siRNA는 PEG-DB와 함께 복합 화 되어 세포 외 pH에서 중립으로 충전 되 고 안정성이 높게 유지 되 고 있으 나 산 성 pH에서 지질 이중 층을 교란 시켜 siRNA 페이로드의 세포 졸 전달을 보장 한다.

본 명세서는 PEG-DB 로부터 si-NPs를 생산 하는 실험 절차를 설명 한다. 이 화학적 매개 변수를 특성화 하는 방법과 si-NPs의 생물 활성을 제시 하 고 논의 합니다. 신속 하 게 si-NP 생물 활성을 평가 하기 위해, 루시퍼 라 제는 녹 다운 연구를 위한 모델 유전자로 서 사용 된다. 반딧불이의 루시퍼 라 제에는 ‘ 글로우 ‘를 담당 하는 프로 틴²⁷가 있습니다. 이에 따라, 상기 반딧불 루시퍼 라 제 유전자로 형질 감염 된 포유류 세포는 루미 노 미터를 이용 하 여 포획 하 여 루시퍼 라 제 발현 수준을 정량화 할 수 있는 바이오 발광 ‘ 발광 ‘을 생성 한다. 여기서 우리는 루시퍼 라 제를 사용 하 여 루시퍼 라 제에 대 한 siRNA를 제공 하 고 루시퍼 라 제 발현 세포의 생물 발광에 상응 하는 감소를 정량화 하 여 스크램블 된 siRNA를 받는 세포와 비교 하 여 시-NPs의 생물 활성을 평가 합니다.

Protocol

1. 시-NPs의 준비 및 특성화 si-NP 준비 3.33 Mg/ml의 구 연산 완충 액 (pH 4.0)에서 10 mM의 고분자를 녹 이세요. 중합체는 먼저 용 해를 보장 하기 위해 에탄올에 10 배 농도로 용 해 될 수 있다.참고: 고분자는 낮은 농도에서 용 해 될 수 있지만, 3.33 mg/m l 이상의 농도에서 사용 하 여 균질 한 NP 형성을 방지할 수 있습니다. SiRNA (50 μ m)를 추가하 여 N+:P 10의 비율로 생성…

Representative Results

생체 내 siRNA 전달을 위한 효과적인 si-NPs의 몇 가지 필수적인 특성은 적절 한 크기 (~ 200 nm 직경), siRNA 패키징 및 유전자 침묵 생물 활성 이다. 이것은 완전 한 목록 (토론에서 언급 된 대로)이 아니지만, 이러한 기본 특성은 제제의 추가 테스트를 고려 하기 전에 확인 되어야 합니다. 도 2 는 제제 화 시의 SI-…

Discussion

여기에 설명 된 si-NPs는 음이온 성 siRNA와 양이온 고분자를 폴 리 이온 복합체 (폴 리 플렉스)로 정전기 협회에 의해 형성 됩니다. PEG-DB 중합체의 siRNA 및 양이온 DB 블록의 정전기 적 복합체는 낮은 pH (4.0)에서 혼합 하 여 촉진 된다. PH 4.0에서 DMAEMA는 고도로 양성자 화 되어 결과적으로 DB 블록이 매우 충전 됩니다. 이것은 중합체가 미 셀을 형성 하는 것과 반대로 용액에서 unimers로 용 해 되 고 siRNA로 ?…

Materials

0.45 mm pore-size syringe filters	Thermo Fisher Scientific	F25133	17 mm diameter, PTFE membrane
0-14 pH test strips	Millipore Sigma	P4786
10x TAE buffer	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	AM9869
6-7.7 pH test strips	Millipore Sigma	P3536
96-well black walled plates	Corning	3603	Tissue-culture treated
Agarose Powder	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	16500
Citric acid monohydrate	Millipore Sigma	C1909
dibasic sodium phosphate dihydrate	Millipore Sigma	71643
D-luciferin	Thermo Fisher Scientific	88294	Monopotassium Salt
DMEM	Gibco	11995065	High glucose and pyruvate
Ethanol	Millipore Sigma	459836
ethidium bromide	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	15585011
FBS	Gibco	26140079
loading dye	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	R0611
Luciferase siRNA	IDT	N/A	Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells	GenTarget Inc	SC059-Bsd	Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity
monobasic sodium phosphate monohydrate	Millipore Sigma	S9638
Scarmbled siRNA	IDT	N/A	Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases
square polystyrene cuvettes	Fisher Scientific	14-955-129	4.5 mL capacity
TEM grids	Ted Pella, Inc.	1GC50	PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper
Trisodium citrate dihydrate	Millipore Sigma	S1804
uranyl acetate	Polysciences, Inc.	21447-25