通过自由浮动免疫荧光测定,在皮外神经纤维中定位阿尔法核糖核酸聚合体
Summary
在这里,我们提出了一个协议,在皮肤活检部分自由浮动间接免疫荧光测定,允许识别疾病特异性形态变异的阿尔法核糖核酸与多种蛋白质外围神经系统。
Abstract
迄今为止,对于大多数神经退行性疾病,只有死后组织病理学的明确诊断可用。对于帕金森病 (PD),诊断仍然只依赖于运动参与的临床迹象,这些症状在疾病过程中出现,当时大多数多巴胺能神经元已经丢失。因此,我们强烈需要一种生物标志物,能够识别疾病开始时的患者或有患疾病的风险。在过去几年中,皮肤活检已被证明是一个优秀的研究和诊断工具,为周围神经疾病,如小纤维神经病变。有趣的是,一种小纤维神经病变和α核糖核酸(βSyn)神经沉积已经通过PD患者的皮肤活检显示。事实上,皮肤活检具有一种易于接近、微创和无痛的手术,能够分析易发生病理学的周围神经组织。此外,在同一患者的随访过程中重复皮肤活检的可能性允许研究与疾病进展的纵向相关性。我们建立了一个标准化的可靠协议,以研究PD患者皮肤神经纤维中是否存在βSyn聚集体。该协议涉及几个短的固定步骤,一个冷冻体切片,然后一个自由浮动免疫荧光双染色与两个特定的抗体:抗蛋白基因产品9.5(PGP9.5),以标记皮神经纤维和抗5G4检测*Syn 聚合。它是一种多功能、敏感且易于执行的协议,也可用于靶向皮肤神经中感兴趣的其他蛋白质。标记 _Syn 聚合体的能力是使用皮肤活检作为建立 PD 的验尸前组织病理学诊断的工具的又一进步。
Introduction
皮肤活检作为神经疾病领域的诊断和研究工具,已经变得越来越重要。事实上,表皮和真皮含有丰富的体性感觉神经纤维(骨髓和未骨髓),感知自由神经末梢,感觉受体和汗腺、血管、皮脂腺和肌肉呼吸体毛质的自主内侧2.
在20世纪中叶,PGP9.5抗体的免疫组织化学设置为人类表皮哺乳动物皮肤的广泛内生提供了证据。PGP9.5 是一种沿中枢和周围神经系统 (PNS) 的轴子均匀分布的碳化物终端水解酶。这种抗体的可得性不仅澄清了皮肤中PNS的形态和解剖学,还实现了与PNS相关的疾病的研究3,4。皮肤活检有助于定义一个新的临床实体:小纤维神经病变。几个国际团体通过皮肤活检分析证明了皮内神经纤维的丧失与小纤维神经病变5的症状/体征之间的联系,并为神经活检和神经活检提供了标准化的规程规范参考值用于临床实践6,7,8。
最近大量证据表明,神经退行性疾病,其特点是中枢神经系统中蛋白质积累错误,是多系统疾病。事实上,PD的特点是在基斯坦尼格拉的多巴胺能神经元中积累βSyn,但已经证明,βSyn及其病理形式磷酸化βSyn(P-αSyn)也可以在外围组织中检测到。胃肠粘液10,唾液腺11,皮肤自主纤维周围的汗腺和皮洛运动肌肉12,13,14,显示免疫反应的致病形式βSyn,在根据布拉克的假说,耐人寻味的假设,_Syn病理学可能开始在PNS提前,在它在大脑积累15。此外,p-syn 的存在已在 REM 行为障碍患者的皮肤神经中得到证明,这些患者被视为前体 PD16,17因此皮肤病理学 _Syn 可被视为有前途的早期外周核糖核酸组织病理学标记。
小纤维神经病变在PD的关联已经证明之前,并已发现,皮内神经纤维密度反映疾病进展18,19。因此,皮肤活检是研究PD神经退化和建立疾病的验尸前组织病理学诊断的有用工具。事实上,皮肤活检具有一个很大的优势,是一个容易接近和微创的程序,允许分析容易发生病理的神经组织。最后,在同一患者的随访过程中重复皮肤活检的可能性允许研究与疾病进展的纵向相关性。
在我们的实验室中,利用PGP9.5和构象特异性单克隆5G4抗体的双重免疫染色,识别疾病特定形式的βSyn,包括小聚合体20,21,我们能够显示在皮肤神经中存在βSyn聚集,具有有前途的高诊断效率19。结合蛋白质聚集物的检测和体内神经退化的测量,对构象性疾病的皮肤活检进行免疫荧光分析,是生物标志物的一个有前途的来源。下面,我们演示了处理皮肤活检和执行自由浮动免疫荧光染色以检测 _Syn 聚合物的简单而通用的协议。此外,该协议可以适应针对皮肤PNS表达的任何其他感兴趣的蛋白质。
以下研究方案已用于评估在PDPNS中通过皮肤活检19聚合+Syn分析的诊断效用。PD的纳入标准是:根据英国脑库诊断标准进行明确的临床诊断,疾病持续时间至少3年,无家族史,历史上无重大认知障碍或主要失学症状。排除标准是已知神经病变的原因(糖化血红蛋白、肌氨酸、维生素B12、TSH、血清免疫修复、艾滋病毒、丙肝病毒、梅毒和结节)。每个受试者在三个解剖部位(颈部在C8皮肤水平,大腿在膝盖上方10厘米,腿在侧侧10厘米以上)进行3毫米直径的皮肤活检,这在临床上受到的影响更大。一般来说,以下方案是关于处理皮肤活检和执行自由浮动免疫荧光染色和分析。因此,它可以被调整和用于检测皮肤组织中感兴趣的其他蛋白质。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们描述了皮肤活检的免费浮动免疫荧光测定,用于诊断PD:它利用抗PGP9.5抗体的双重免疫染色剂、泛化标记物和抗5G4,一种识别聚合形式的构象特异性抗体*Syn。
在PD和可能在其他蛋白质构象障碍中,皮肤活检用于诊断目的的巨大优点是:1) 通过轻度侵入性技术直接进入容易患病的神经组织,从而具有预期的更好的测定与血液或CSF等生物流体相比,对βSyn聚集物的敏感性;2) 有机会检测?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢帕金森·施魏茨和ABREOC(恩德·奥斯佩莱罗·坎登纳莱的科学研究咨询委员会)为这项研究提供了财政支持。
Materials
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2mg/ml |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2mg/ml |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
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