Målretning Alpha Synuclein aggregater i kutane perifer nerve fibre af Free-flydende immunofluorescens analyse

Summary

Her præsenterer vi en protokol for en fritflydende indirekte immunofluorescens assay på hud biopsi sektioner, der giver mulighed for identifikation af sygdomsspecifikke kropsbygnings varianter af alpha synuclein involveret i Parkinsons sygdom og flere proteiner i perifert nervesystem.

Abstract

Til dato, for de fleste neurodegenerative sygdomme er kun en post mortem histopatologisk endelig diagnose tilgængelig. For Parkinsons sygdom (PD), diagnosen stadig kun afhænger af kliniske tegn på motoriske involvering, der vises senere i sygdomsforløbet, når de fleste af de dopaminerge neuroner er allerede tabt. Derfor er der et stort behov for en biomarkør, der kan identificere patienter i begyndelsen af sygdom eller med risiko for at udvikle det. I løbet af de sidste par år har hudbiopsi vist sig at være en fremragende forskning og diagnostisk værktøj til perifere nervesygdomme såsom små fiber neuropati. Interessant, en lille fiber neuropati og alpha synuclein (αSyn) neurale indskud er blevet påvist ved hudbiopsi hos PD patienter. Faktisk, hudbiopsi har den store fordel ved at være en let tilgængelig, minimalt invasiv og smertefri procedure, der gør det muligt at analysere perifere nerve væv tilbøjelige til patologi. Desuden muligheden for at gentage huden biopsi i løbet af opfølgningen af den samme patient giver mulighed for at studere i længderetningen sammenhæng med sygdomsprogression. Vi har oprettet en standardiseret pålidelig protokol til at undersøge tilstedeværelsen af αSyn aggregater i hud nervefibre af PD patienten. Denne protokol omfatter kun få korte fikserings trin, en kryotomsektionering og derefter en fritflydende immunofluorescens, dobbelt farvning med to specifikke antistoffer: anti protein Genprodukt 9,5 (PGP 9.5) til at markere kutane nervefibre og anti 5G4 til påvisning af αSyn aggregater. Det er en alsidig, følsom og nem at udføre protokol, der også kan anvendes til at målrette andre proteiner af interesse i huden nerver. Evnen til at markere αSyn aggregater er endnu et skridt frem mod anvendelse af hudbiopsi som et redskab til at etablere en præ-mortem histopatologisk diagnose af PD.

Introduction

Skin biopsi har fået en stor betydning som diagnostisk og forskning værktøj inden for neurologiske lidelser¹. Faktisk, epidermis og dermis indeholder rigelige somatiske sensoriske nervefibre (myelinerede og umyelineret), nociceptive frie nerveender, sensoriske receptorer og autonom innervation af svedkirtler, kar, talgkirtler og muskel arrector pilorum ². i.

I midten af 20^th århundrede, opsætningen for Immunhistokemi af PGP 9.5 antistof tilladt bevis for en omfattende innervation af humant epidermis pattedyr hud³. PGP 9.5 er en carboxyl-Terminal lav affinitet ligeligt fordelt langs axoner af både det centrale og perifere nervesystem (PNS). Tilgængeligheden af dette antistof tilladt ikke kun at afklare morfologi og anatomi af PNS i huden, men også implementeret studiet af sygdomme forbundet med det^3,4. Hudbiopsi bidrog til at definere en ny klinisk enhed: den lille fiber neuropati. Flere internationale grupper viste sammenhæng mellem tabet af intraepidermal nervefibre og symptomer/tegn på lille fiber neuropati⁵ ved Skin biopsi analyse og forudsat standardiserede protokoller for nerve morphometri samt normative referenceværdier, der skal anvendes i den kliniske praksis^6,7,8.

For nylig en stor mængde af beviser har vist, at neurodegenerative sygdomme, karakteriseret ved misfoldet protein akkumuleringer i det centrale nervesystem, er multi-system patologier⁹. Faktisk, PD er karakteriseret ved αsyn akkumulering i dopaminerge neuron af substantia nigra, men det er blevet påvist, at αsyn og dets patologiske form, fosforyleres αsyn (P-αsyn), kunne påvises også i det perifere væv. Gastrointestinalt slimhinde¹⁰, spytkirtler¹¹, hudens autonome fibre omkring svedkirtler og pilomotor muskler^12,13,14, viser immunoreactivity til patogene former af αsyn, i overensstemmelse med Braak-hypotesen om, at det er interessant at postulere, at αSyn patologi kan begynde i PNS i god tid før dens akkumulering i hjernen¹⁵. Desuden er tilstedeværelsen af p-αsyn blevet påvist i hudens nerver af patienter med rem-adfærdsforstyrrelser, som anses for at være prodromale PD^16,17 således kan hudpatologisk αsyn betragtes som en lovende tidlig perifer histopatologisk markør for synukleinopati.

Sammenslutningen af små fiber neuropati i PD er blevet påvist tidligere, og det er blevet konstateret, at intraepidermal nervefibre tæthed afspejler sygdomsprogression^18,19. Derfor er huden biopsi et nyttigt redskab til at studere neurodegeneration i PD og til at etablere en præ-mortem histopatologisk diagnose af sygdommen. Faktisk, hudbiopsi har en stor fordel ved at være en let tilgængelig og minimalt invasive procedure, så analysen af nervevævet tilbøjelig til patologi. Endelig muligheden for at gentage huden biopsi i løbet af opfølgningen af de samme patienter giver mulighed for at studere i længderetningen sammenhæng med sygdomsprogression.

I vores laboratorium, udnytter en dobbelt immuno-farvning med PGP 9.5 og konformation-specifikke monoklonale 5g4 antistof, der genkender sygdomsspecifikke former for αsyn herunder små aggregater^20,21, vi var i stand til at vise tilstedeværelsen af αSyn aggregater i huden nerver med en lovende høj diagnostisk effektivitet¹⁹. Immunofluorescens analyse af hudbiopsi i konformationelle sygdomme skiller sig ud som en lovende kilde til biomarkører ved at kombinere både påvisning af protein aggregater og måling af neurodegeneration in vivo. Herefter illustrerer vi en let og alsidig protokol om håndtering af hudbiopsi og udførelse af fritflydende immunofluorescens farvning til påvisning af αSyn aggregater. Desuden kan denne protokol tilpasses til at målrette ethvert andet protein af interesse udtrykt i huden PNS.

Følgende studie protokol er blevet anvendt til at evaluere den diagnostiske nytte af aggregeret αSyn analyse i PNS af PD ved hud biopsi¹⁹. Inklusionskriterier for PD var: en klar klinisk diagnose i henhold til den britiske Brain bank diagnostiske kriterier, sygdom varighed mindst 3 år, ingen slægtshistorie, og ingen større kognitiv svækkelse eller større dysautonomiske symptomer i historien. Udelukkelseskriterier var kendte årsager til neuropati (glycated hæmoglobin, kreatinin, vitamin B12, TSH, serum immunofiksation, HIV, HCV, syfilis, og borreliose). Hvert emne gennemgik 3 mm-diameter hud biopsier på tre anatomiske steder (hals på C8 dermatomal niveau, lår 10 cm over knæet, Ben 10 cm over lateral malleolus) på siden, som var klinisk mere påvirket. Generelt er følgende protokol handler om håndtering af huden biopsi og udføre den fritflydende immunofluorescens farvning og analyse. Derfor kan det tilpasses og anvendes til påvisning af andre proteiner af interesse i hudvæv.

Protocol

Protokollen er blevet godkendt af den kantonale etiske komité, og alle tilmeldte forsøgspersoner gav skriftligt informeret samtykke til undersøgelsen. 1. Skin biopsi Collection Lad en kvalificeret læge udføre hudbiopsien i en passende klinisk indstilling. Vælg området for at udføre huden biopsi og rense det med en spritserviet. Forbered anæstesi opløsningen med 1 CC lidocain 2%. Med nålen parallelt med området, injicere lokale anæstesi subku…

Representative Results

Efter den beskrevne procedure (figur 1), vi detekterede αsyn aggregater, mærket med 5G4 antistof, i dermal nerve fascicles innerverende autonome strukturer PD patienter. Morfologi af alpha-synuclein indskud vises som et punkteret signal langs axoner af dermal nerver (figur 2). Faktisk, at udnytte denne protokol i 19 PD patienter og 17 kontrol i huden biopsier på tre anatomiske sted (cervikal, lår og distale ben) fandt vi, at 5G4 havde 81% følsomhed og 86% a…

Discussion

Vi beskriver en fritflydende immunofluorescens analyse for hud biopsier til diagnosticering af PD: det udnytter dobbelt immun farvning med anti-PGP 9.5 antistof, en panaxonal markør, og anti-5G4, en konformation specifikke antistof, der genkender den aggregerede form af αSyn.

De store fordele ved hud biopsi til diagnostisk formål i PD og eventuelt i andre protein konformationelle lidelser er: 1) direkte adgang til nerve væv tilbøjelige til sygdom ved en mildt invasiv teknik og dermed med …

Materials

5G4 (anti human αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mouse monoclonal
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG	Invitrogen	1971418	2mg/ml
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG	Invitrogen	1922849	2mg/ml
Disodium hydrogen phosphate solution	Merk Millipore	106586
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
L-Lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyde	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	Rabbit polyclonal
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck Millipore	106346
Sodium (meta)periodate	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Mounting medium