Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Kutane periphere Nervenfasern durch frei schwebenden Immunfluoreszenz-Assay
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für einen frei schwebenden indirekten Immunfluoreszenz-Assay auf Hautbiopsieabschnitten vor, das die Identifizierung von krankheitsspezifischen Konformationsvarianten von Alpha-Synuclein ermöglicht, die an der Parkinson-Krankheit und mehreren Proteinen der peripheren Nervensystems.
Abstract
Bis heute steht für die meisten neurodegenerativen Erkrankungen nur eine postmortale histopathologische definitive Diagnose zur Verfügung. Bei der Parkinson-Krankheit (PD) beruht die Diagnose immer noch nur auf klinischen Anzeichen einer motorischen Beteiligung, die später im Krankheitsverlauf auftreten, wenn die meisten dopaminergen Neuronen bereits verloren sind. Daher besteht ein starker Bedarf an einem Biomarker, der Patienten zu Beginn der Krankheit oder mit dem Risiko, sie zu entwickeln, identifizieren kann. In den letzten Jahren hat sich die Hautbiopsie als ausgezeichnetes Forschungs- und Diagnoseinstrument für periphere Nervenkrankheiten wie kleine Faserneuropathie erwiesen. Interessanterweise, eine kleine Faser Neuropathie und Alpha-Synuclein (Syn) neuronale Ablagerungen wurden durch Hautbiopsie bei PD-Patienten gezeigt. Tatsächlich hat die Hautbiopsie den großen Vorteil, dass sie ein leicht zugängliches, minimalinvasives und schmerzloses Verfahren ist, das die Analyse von peripherem Nervengewebe ermöglicht, das anfällig für die Pathologie ist. Darüber hinaus ermöglicht die Möglichkeit, die Hautbiopsie im Zuge der Nachbeobachtung desselben Patienten zu wiederholen, die Untersuchung der Längskorrelation mit dem Krankheitsverlauf. Wir haben ein standardisiertes, zuverlässiges Protokoll eingerichtet, um das Vorhandensein von Syn-Aggregaten in den Hautnervenfasern des PD-Patienten zu untersuchen. Dieses Protokoll beinhaltet nur wenige kurze Fixierungsschritte, eine Kryotome-Sektion und dann eine frei schwebende Immunfluoreszenz-Doppelfärbung mit zwei spezifischen Antikörpern: Antiprotein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5), um die hautförmigen Nervenfasern zu markieren, und Anti-5G4 zum Nachweis Syn-Aggregate. Es ist ein vielseitiges, empfindliches und einfach durchzuführendes Protokoll, das auch für andere Proteine angewendet werden kann, die für Hautnerven von Interesse sind. Die Fähigkeit, Syn-Aggregate zu markieren, ist ein weiterer Schritt nach vorn bei der Verwendung der Hautbiopsie als Werkzeug zur Etablierung einer vor-mortem histopathologischen Diagnose von PD.
Introduction
Die Hautbiopsie hat als diagnostisches und forschungsmedizinisches Instrument im Bereich neurologischer Erkrankungen1eine große Bedeutung erlangt. Tatsächlich enthalten Epidermis und Dermis reichlich somatische sensorische Nervenfasern (myeliniert und unmyeliniert), nozizeptive freie Nervenenden, sensorische Rezeptoren und autonome Innervation von Schweißdrüsen, Gefäßen, Talgdrüsen und Muskelarrector Pilorum 2.
In der Mitte des 20. Jahrhunderts erlaubte das Setup für die Immunhistochemie von PGP9.5-Antikörpern den Nachweis einer umfangreichen Innervation der menschlichen Epidermis-Säugetierhaut3. PGP9.5 ist eine Carboxyl-Terminal-Hydrolase, die gleichmäßig entlang von Axonen des zentralen und peripheren Nervensystems (PNS) verteilt ist. Die Verfügbarkeit dieses Antikörpers ermöglichte es nicht nur, die Morphologie und Anatomie von PNS in der Haut zu klären, sondern auch die Untersuchung von damit verbundenen Krankheiten3,4. Die Hautbiopsie trug zur Definition einer neuen klinischen Einheit bei: der kleinen Faserneuropathie. Mehrere internationale Gruppen demonstrierten den Zusammenhang zwischen dem Verlust von intraepidermalen Nervenfasern und Symptomen/Zeichen einer kleinen Faserneuropathie5 durch Hautbiopsieanalyse und lieferten standardisierte Protokolle für die Nervenmorphometrie sowie normative Referenzwerte, die in der klinischen Praxis verwendet werden sollen6,7,8.
Kürzlich hat eine große Menge an Beweisen gezeigt, dass neurodegenerative Erkrankungen, gekennzeichnet durch falsch gefaltete Proteinansammlungen im zentralen Nervensystem, Multisystempathologiensind 9. In der Tat, PD ist gekennzeichnet durch die Syn-Akkumulation im dopaminergen Neuron von Substantia nigra, aber es wurde gezeigt, dass ,Syn und seine pathologische Form, phosphoryliertes Syn (P-Syn), auch in den peripheren Geweben nachgewiesen werden konnte. Magen-Darm-Schleimhaut10, Speicheldrüsen11, hautautonome Fasern um Schweißdrüsen und pilomotorische Muskeln12,13,14, zeigen Immunreaktivität zu pathogenen Formen von Syn, in nach Braak Hypothese, dass faszinierend postulieren, dass ‘Syn Pathologie kann in PNS lange im Voraus beginnen, vor seiner Akkumulation im Gehirn15. Darüber hinaus wurde das Vorhandensein von p-Syn in Hautnerven von Patienten mit REM-Verhaltensstörungen nachgewiesen, die als prodromal PD16,17 gelten, so dass hautpathologische Syn als vielversprechende frühe periphere histopathologischen Marker der Synukenopathie.
Der Zusammenhang der kleinen Faserneuropathie in PD wurde bereits gezeigt und es wurde festgestellt, dass intraepidermale Nervenfasern Dichte reflektiert Krankheitsprogression18,19. Daher ist die Hautbiopsie ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Neurodegeneration bei PD und für die Etablierung einer vor-mortem histopathologischen Diagnose der Krankheit. Tatsächlich hat die Hautbiopsie einen großen Vorteil, ein leicht zugängliches und minimalinvasives Verfahren zu sein, das die Analyse von Nervengewebe ermöglicht, das anfällig für die Pathologie ist. Schließlich ermöglicht die Möglichkeit, die Hautbiopsie im Zuge der Nachbeobachtung der gleichen Patienten zu wiederholen, die Untersuchung der Längskorrelation mit dem Fortschreiten der Erkrankung.
In unserem Labor, die Nutzung einer doppelten Immunfärbung mit PGP9.5 und dem konformen monoklonalen 5G4-Antikörper, der krankheitsspezifische Formen von Syn einschließlich kleiner Aggregate20,21, erkennt, konnten wir die Vorhandensein von Syn-Aggregaten in Hautnerven mit einer vielversprechenden hohen diagnostischen Effizienz19. Die Immunfluoreszenzanalyse der Hautbiopsie bei Konformationserkrankungen zeichnet sich als vielversprechende Quelle von Biomarkern aus, indem sowohl der Nachweis von Proteinaggregaten als auch das Maß der Neurodegeneration in vivo kombiniert werden. Im Folgenden veranschaulichen wir ein einfaches und vielseitiges Protokoll über den Umgang mit der Hautbiopsie und die Durchführung der frei schwebenden Immunfluoreszenzfärbung zum Nachweis von Syn-Aggregaten. Darüber hinaus kann dieses Protokoll angepasst werden, um jedes andere Protein von Interesse, das in Haut-PNS ausgedrückt wird, zu zielen.
Das folgende Studienprotokoll wurde verwendet, um den diagnostischen Nutzen der aggregierten Syn-Analyse in den PNS von PD durch Hautbiopsie19zu bewerten. Inklusionskriterien für PD waren: eine definitive klinische Diagnose nach den diagnostischen Kriterien der UK Brain Bank, die Krankheitsdauer von mindestens 3 Jahren, keine Familiengeschichte und keine größeren kognitiven Beeinträchtigungen oder großen dysautonomen Symptome in der Geschichte. Ausschlusskriterien waren bekannte Ursachen der Neuropathie (glykiertes Hämoglobin, Kreatinin, Vitamin B12, TSH, Serumimmunfixation, HIV, HCV, Syphilis und Borreliose). Jedes Subjekt wurde an drei anatomischen Stellen (Hals bei C8-Dermatomal, Oberschenkel 10 cm über dem Knie, Bein 10 cm über seitlichem Malleolus) seitlich mit 3 mm Durchmesser biopsien, was klinisch stärker betroffen war. Im Allgemeinen geht es im folgenden Protokoll um den Umgang mit der Hautbiopsie und die Durchführung der frei schwebenden Immunfluoreszenzfärbung und -analyse. Daher kann es angepasst und für den Nachweis anderer Proteine von Interesse im Hautgewebe verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben einen frei schwebenden Immunfluoreszenz-Assay für Hautbiopsien zur Diagnose von PD: Er nutzt die doppelte Immunfärbung mit Anti-PGP9.5-Antikörpern, einem panaxonalen Marker und Anti-5G4, einem konformationsspezifischen Antikörper, der die aggregierte Form erkennt. von Syn.
Die großen Vorteile der Hautbiopsie zu diagnostischen Zwecken bei PD und möglicherweise bei anderen Proteinkonformationsstörungen sind: 1) der direkte Zugang zu krankheitsanfälligem Nervengewebe durch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Parkinson Schweiz und ABREOC (dem Wissenschaftlichen Forschungsbeirat der Ente Ospedaliero Cantonale) für die finanzielle Unterstützung dieser Studie.
Materials
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2mg/ml |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2mg/ml |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
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