Targeting Alpha Synuclein Aggregati in cutaneous periferici nervose fibre nervose da Pro(Enunciante autofluorescenza libera)
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per un test di immunofluorescenza indiretta a fluttuazione libera sulle sezioni di biopsia cutanea che consente l’identificazione di varianti di conformazione specifiche della malattia di sinucleina alfa coinvolte nella malattia di Parkinson e proteine multiple del sistema nervoso periferico.
Abstract
Ad oggi, per la maggior parte delle malattie neurodegenerative è disponibile solo una diagnosi definitiva istopatologica post-mortem. Per il morbo di Parkinson (PD), la diagnosi si basa ancora solo su segni clinici di coinvolgimento motorio che appaiono più tardi nel corso della malattia, quando la maggior parte dei neuroni dopaminergici sono già persi. Quindi, c’è una forte necessità di un biomarcatore in grado di identificare i pazienti all’inizio della malattia o a rischio di svilupparlo. Negli ultimi anni, la biopsia cutanea si è rivelata un eccellente strumento di ricerca e diagnostica per le malattie nervose periferiche come la piccola neuropatia delle fibre. È interessante notare che, una piccola neuropatia della fibra e sinucleina alfa (SynSyn) depositi neurali sono stati mostrati dalla biopsia della pelle in pazienti affetti da PD. Infatti, la biopsia cutanea ha il grande vantaggio di essere una procedura facilmente accessibile, minimamente invasiva e indolore che consente l’analisi del tessuto nervoso periferico incline alla patologia. Inoltre, la possibilità di ripetere la biopsia cutanea nel corso del follow-up dello stesso paziente consente di studiare la correlazione longitudinale con la progressione della malattia. Abbiamo istituito un protocollo affidabile standardizzato per studiare la presenza di aggregati di Syn nelle fibre nervose della pelle del paziente PD. Questo protocollo prevede pochi brevi passaggi di fissazione, una sezionamento criotomeo e poi una doppia colorazione immunofluorescenza a fluttuazione libera con due anticorpi specifici: antiproteina Gene Product 9.5 (PGP9.5) per contrassegnare le fibre nervose cutanee e anti 5G4 per la rilevazione di : syn. Si tratta di un protocollo versatile, sensibile e facile da eseguire che può essere applicato anche per colpire altre proteine di interesse nei nervi della pelle. La capacità di contrassegnare gli aggregati di Syn è un altro passo avanti verso l’uso della biopsia cutanea come strumento per stabilire una diagnosi istologica pre-mortem della PD.
Introduction
La biopsia cutanea ha acquisito una grande importanza come strumento diagnostico e di ricerca nel campo dei disturbi neurologici1. Infatti, epidermide e dermide contengono abbondanti fibre nervose sensoriali somatiche (mielinate e non mitielinate), terminazioni nervose libere nocicettive, recettori sensoriali e innervazione autonoma di ghiandole sudoripare, vasi, ghiandole sebacee e muscolo arrectorilorum 2.
A metà del XX secolo, l’installazione per l’immunohistochimica dell’anticorpo PGP9.5 ha permesso l’evidenza di un’ampia innervazione della pelle di mammifero dell’epidermide umana3. PGP9.5 è un’idrolasi carboxyl-terminale equamente distribuita insieme agli assoni del sistema nervoso centrale e periferico (PNS). La disponibilità di questo anticorpo ha permesso non solo di chiarire la morfologia e l’anatomia del PNS nella pelle, ma ha anche implementato lo studio delle malattie ad esso associate3,4. La biopsia cutanea ha contribuito alla definizione di una nuova entità clinica: la piccola neuropatia delle fibre. Diversi gruppi internazionali hanno dimostrato l’associazione tra la perdita di fibre nervose intraepidermiche e sintomi/segni di nevropatia delle piccole fibre5 mediante l’analisi della biopsia cutanea e hanno fornito protocolli standardizzati per la morfometria nervosa e valori di riferimento normativi da utilizzare nella pratica clinica6,7,8.
Recentemente una grande quantità di prove ha dimostrato che le malattie neurodegenerative, caratterizzate da accumuli di proteine piegate in modo improprio nel sistema nervoso centrale, sono patologie multi-sistema9. Infatti, la PD è caratterizzata dall’accumulo di sinistre nel neurone dopaminergico di substantia nigra, ma è stato dimostrato che la Sindsyn e la sua forma patologica, il fosforilo, il sinsyn (P-Syn), potrebbe essere rilevata anche nei tessuti periferici. Musco-intestinalemucosa 10, ghiandole salivari11, fibre autonomiche della pelle che circondano le ghiandole sudoripare e muscoli pilomotori12,13,14, mostrano l’immunoreattività alle forme patogene di secondo l’ipotesi di Braak che intrigantemente postulare che la patologia di Syn può iniziare in PNS con largo anticipo, prima del suo accumulo nel cervello15. Inoltre, è stata dimostrata la presenza di p–Syn Syn nei nervi della pelle di pazienti con disturbi del comportamento REM che sono considerati prodromal PD16,17 quindi la pelle patologica -Syn può essere considerata una promettente periferica precoce marcatore istopatologico della sinucleinopatia.
L’associazione di piccola neuropatia in fibra nella PD è stata dimostrata in precedenza ed è stato trovato che la densità delle fibre nervose intraepidermiche riflette la progressione della malattia18,19. Quindi, la biopsia cutanea è uno strumento utile per studiare la neurodegenerazione nella PD e per stabilire una diagnosi istopatologica pre-mortem della malattia. Infatti, la biopsia cutanea ha un grande vantaggio di essere una procedura facilmente accessibile e minimamente invasiva, consentendo l’analisi del tessuto nervoso incline alla patologia. Infine, la possibilità di ripetere la biopsia cutanea nel corso del follow-up degli stessi pazienti consente di studiare la correlazione longitudinale con la progressione della malattia.
Nel nostro laboratorio, sfruttando una doppia colorazione immuno-intura con PGP9.5 e l’anticorpo monoclonale 5G4 specificodella conformazione, che riconosce le forme specifiche della malattia di la presenza di srl aggrega nei nervi della pelle con una promettente elevata efficienza diagnostica19. L’analisi dell’immunofluorescenza della biopsia cutanea nelle malattie conformazionali si distingue come una promettente fonte di biomarcatori combinando sia la rilevazione di aggregati proteici che la misura della neurodegenerazione in vivo. Di seguito, illustreremo un protocollo facile e versatile sulla gestione della biopsia cutanea e sull’esecuzione della colorazione dell’immunofluorescenza a fluttuazione libera per rilevare gli aggregati di syn. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per colpire qualsiasi altra proteina di interesse espressa nel PNS della pelle.
Il seguente protocollo di studio è stato utilizzato per valutare l’utilità diagnostica dell’analisi aggregata di Ssyn nel PNS della PD mediante biopsia cutanea19. I criteri di inclusione per la PD erano: una diagnosi clinica definita secondo i criteri diagnostici della Banca del cervello del Regno Unito, la durata della malattia di almeno 3 anni, nessuna storia familiare, e nessun grave danno cognitivo o principali sintomi disautonomici nella storia. I criteri di esclusione erano noti cause di neuropatia (emoglobina glicata, creatinina, vitamina B12, TSH, immunofissia del siero, HIV, HCV, sifilide e borreliosi). Ogni soggetto è stato sottoposto a biopsie cutanee di 3 mm di diametro in tre siti anatomici (collo a livello dermatomico C8, coscia 10 cm sopra il ginocchio, gamba 10 cm sopra malleolus laterale) sul lato, che era clinicamente più colpito. In generale, il seguente protocollo riguarda la gestione della biopsia cutanea e l’esecuzione della colorazione e dell’analisi dell’immunofluorescenza a fluttuazione libera. Quindi può essere adattato e utilizzato per il rilevamento di altre proteine di interesse nel tessuto cutaneo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo un test di immunofluorescenza fluttuante per le biopsie cutanee per la diagnosi della PD: sfrutta la doppia immunostaining con anticorpi anti-PGP9.5, un marcatore panassonale e anti-5G4, un anticorpo specifico della conformazione che riconosce la forma aggregata di “Syn”.
I grandi vantaggi della biopsia cutanea a scopo diagnostico nella PD e possibilmente in altri disturbi conformazionali proteici sono: 1) l’accesso diretto al tessuto nervoso incline alla malattia con una tecnica l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Parkinson Schweiz e ABREOC (comitato consultivo per la ricerca scientifica dell’Enteo Cantonale) per il loro sostegno finanziario a questo studio.
Materials
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2mg/ml |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2mg/ml |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
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