自由浮遊免疫蛍光アッセイによる皮下末梢神経線維におけるアルファシヌクレイン凝集体の標的化
Summary
ここでは、パーキンソン病に関与するαシヌクレインの疾患特異的立体構造変異体および複数のタンパク質の同定を可能にする皮膚生検セクションにおける自由浮遊間接免疫蛍光アッセイのプロトコルを提示する。末梢神経系。
Abstract
現在までに、ほとんどの神経変性疾患については、死後の病理学的確定診断のみが利用可能である。パーキンソン病(PD)の場合、診断は、ドーパミン作動性ニューロンのほとんどが既に失われている場合、疾患コースで後に現れる運動関与の臨床徴候にのみ依存しています。したがって、病気の初めに、またはそれを発症するリスクがある患者を識別できるバイオマーカーの強い必要性があります。ここ数年、皮膚生検は、小さな繊維神経障害などの末梢神経疾患の優れた研究および診断ツールであることが証明されています。興味深いことに、小さな繊維神経障害およびαシヌクレイン(αSyn)神経沈着物は、PD患者における皮膚生検によって示されている。確かに、皮膚生検は、病理学になりやすい末梢神経組織の分析を可能にする、簡単にアクセス可能で、最小限に侵襲的で痛みのない手順であるという大きな利点を有する。さらに、同じ患者のフォローアップの過程で皮膚生検を繰り返す可能性は、疾患進行との縦方向の相関関係を研究することを可能にする。我々は、PD患者の皮膚神経線維におけるαSyn凝集体の存在を調査するために、標準化された信頼性の高いプロトコルを設定した。このプロトコルは、いくつかの短い固定ステップ、クライオトーム断面、次に2つの特異的抗体を用いた自由浮遊免疫蛍光二重染色を伴う:抗タンパク質遺伝子産物9.5(PGP9.5)を用いて、皮膚神経線維と検出のための抗5G4をマークする。αSyn凝集体。それはまた、皮膚神経に関心のある他のタンパク質を標的にするために適用することができる汎用性、敏感で簡単にプロトコルを実行することができます。αSyn凝集体をマークする能力は、PDの死後前の病理学的診断を確立するためのツールとしての皮膚生検の使用に向けたもう一つの一歩である。
Introduction
皮膚生検は神経障害1の分野における診断および研究ツールとして非常に重要である。実際、表皮と真皮には、豊富な体性感覚神経線維(骨髄および未骨髄)、受容性の自由な神経終末、感覚受容体および汗腺、血管、皮脂腺および筋肉の難解な陰核の自律神経の内線が含まれている。2.
20世紀半ばに、PGP9.5抗体の免疫組織化学のセットアップは、ヒト表皮哺乳類皮膚3の広範な内部性の証拠を可能にした。PGP9.5は、中枢および末梢神経系(PNS)の軸に沿って均等に分布するカルボキシル末端ヒドロラーゼである。この抗体の利用可能性は、皮膚におけるPNSの形態および解剖学を明らかにするだけでなく、それに関連する疾患の研究を実施した3,4を可能にした。皮膚生検は、新しい臨床実体の定義に貢献しました: 小さな繊維神経障害.いくつかの国際グループは、皮膚生検分析による小繊維神経障害5の表記/徴候との関連を示し、神経モルホメトリーおよび標準化されたプロトコルを提供した。臨床実践6、7、8で使用される規範的な参照値。
最近、多量の証拠は、中枢神経系におけるタンパク質蓄積の誤った折りたたみを特徴とする神経変性疾患が、多系統病理9であることを示している。実際、PDは、実はニグラのドーパミン作動性ニューロンにおけるαSyn蓄積によって特徴付けられており、αSynおよびその病理学的形態、リン酸化αSyn(P-αSyn)は、末梢組織においても検出され得ることを実証されている。胃腸粘膜10、唾液腺11、汗腺およびピロ運動筋を取り巻く皮膚自律性線維12、13、14、αSynの病原性形態に対する免疫反応性を示すBraakの仮説によれば、αSyn病理は、脳15に蓄積する前に、PNSで十分に前に始まる可能性があることを興味深く仮説化する。また、p-αSynの存在は、プロドロマルPD16、17と考えられるレム行動障害を有する患者の皮膚神経において実証されており、したがって皮膚病理αSynは有望な早期末梢と考えることができる。シヌクレノパシーの病理学的マーカー。
PDにおける小さな繊維神経障害の関連は以前に実証されており、表皮内神経線維密度が疾患進行18,19を反映していることが見出されている。したがって、皮膚生検は、PDで神経変性を研究し、疾患の死後前の病理学的診断を確立するための有用なツールである。確かに、皮膚生検は、病理学になりやすい神経組織の分析を可能にする、簡単にアクセス可能で最小限に侵襲的な手順であることの大きな利点を有する。最後に、同じ患者のフォローアップの過程で皮膚生検を繰り返す可能性は、疾患の進行との縦方向の相関を研究することを可能にする。
本研究室では、PGP9.5と立体構造特異的モノクローナル5G4抗体を用いた二重免疫染色を利用し、小凝集体20、21を含む疾患特異的形態のαSynを認識し、有望な高い診断効率を持つ皮膚神経におけるαSyn凝集体の存在19.立体構造疾患における皮膚生検の免疫蛍光分析は、タンパク質凝集体の検出と生体内の神経変性の測定の両方を組み合わせることにより、バイオマーカーの有望な供給源として際立っています。以下、皮膚生検を処理し、αSyn凝集体を検出するための自由浮遊免疫蛍光染色を行う上で、簡単で汎用性の高いプロトコルを示す。さらに、このプロトコルは、皮膚PNSで発現される目的の他のタンパク質を標的化するために適合させることができる。
以下の研究プロトコルは、皮膚生検19によるPDのPNSにおける凝集αSyn分析の診断有用性を評価するために用いられた。PDの包含基準は、英国の脳バンク診断基準に従った明確な臨床診断、少なくとも3年の疾患期間、家族歴なし、および歴史上の主要な認知障害または主要な自律神経症状なしであった。除外基準は、神経障害の原因が知られていた(糖化ヘモグロビン、クレアチニン、ビタミンB12、TSH、血清免疫固定、HIV、HCV、梅毒、およびボレリオシス)。各被験者は、3つの解剖学的部位(C8皮膚レベルの首、膝の上の大腿10cm、横マレオラスの上の脚10cm)で3mm径の皮膚生検を受け、臨床的により影響を受けた。一般に、以下のプロトコルは、皮膚生検を処理し、自由浮遊免疫蛍光染色および分析を行うことについてである。したがって、皮膚組織に関心のある他のタンパク質の検出に適応し、使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
PDの診断のための皮膚生検のための自由浮遊免疫蛍光アッセイについて説明する:それは抗PGP9.5抗体、パナキソンマーカー、および抗5G4、凝集形態を認識する立体構造特異的抗体との二重免疫染色を利用するαSynの。
PDおよびおそらく他のタンパク質立体障害における診断目的のための皮膚生検の大きな利点は、:1)軽度に侵襲的な技術によって疾患になりやすい神経組織へ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、パーキンソン・シュバイツとABREOC(エンテ・オスペダリエロ・カントナーレ科学研究諮問委員会)に対し、この研究の財政的支援に感謝する。
Materials
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2mg/ml |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2mg/ml |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
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