Her presenterer vi en protokoll for en frittflytende indirekte immunofluorescence analysen på huden biopsi seksjoner som gjør det mulig for identifisering av sykdom spesifikke konformasjon varianter av Alpha synuclein involvert i Parkinsons sykdom og flere proteiner av perifere nervesystemet.
Hittil, for de fleste nevrodegenerative sykdommer bare en post-obduksjon histopathological definitive diagnosen er tilgjengelig. For Parkinsons sykdom (PD), avhenger diagnosen fortsatt bare på kliniske tegn på motor involvering som vises senere i Sykdomsforløpet, når de fleste av de dopaminerg neurons er allerede tapt. Derfor er det et sterkt behov for en biomarkør som kan identifisere pasienter i begynnelsen av sykdommen eller risikoen for å utvikle den. I løpet av de siste årene, hud biopsi har vist seg å være en utmerket forskning og diagnostisk verktøy for perifere nerve sykdommer som små fiber nevropati. Interessant, en liten fiber nevropati og Alpha synuclein (αSyn) nevrale innskudd har blitt vist av huden biopsi i PD pasienter. Faktisk har huden biopsi den store fordelen av å være en lett tilgjengelig, minimalt invasiv og smertefri prosedyre som gjør at analysen av perifere nervøse vev utsatt for patologi. Videre kan muligheten for å gjenta huden biopsi i løpet av oppfølgingen av den samme pasienten studerer langsgående korrelasjon med sykdomsprogresjon. Vi setter opp en standardisert pålitelig protokoll for å undersøke tilstedeværelsen av αSyn aggregater i hudens nervefibre av PD pasienten. Denne protokollen innebærer noen korte fiksering trinn, en cryotome snitting og deretter en frittflytende immunofluorescence dobbel farging med to spesifikke antistoffer: anti protein Gene Product 9,5 (PGP 9.5) for å markere hud nervefibre og anti 5G4 for å oppdage αSyn aggregater. Det er en allsidig, følsom og lett å utføre protokollen som også kan anvendes for å målrette andre proteiner av interesse i huden nerver. Evnen til å merke αSyn aggregater er et skritt videre til bruk av hud biopsi som et verktøy for å etablere en pre-obduksjon histopathological diagnose av PD.
Skin biopsi har fått en stor betydning som diagnostiske og forskning verktøy innen nevrologiske lidelser1. Faktisk, epidermis og dermis inneholder rikelig somatiske sensoriske nervefibre (myelinated og unmyelinated), nociceptive frie nerve avslutninger, sensoriske reseptorer og autonome innervasjon av svette kjertler, fartøy, talgkjertler og muskel arrector pilorum 2i det.
I midten av 20th århundre, oppsettet for IMMUNHISTOKJEMI av PGP 9.5 antistoff tillot bevis for en omfattende innervasjon av menneskelig epidermis pattedyr hud3. PGP 9.5 er en kar bok syl-Hydrolase like fordelt langs axons av både det sentrale og perifere nervesystemet (PNS). Tilgjengeligheten av dette antistoff tillot ikke bare å avklare morfologi og anatomi av PNS i huden, men også implementert studiet av sykdommer knyttet til den3,4. Hud biopsi bidro til å definere en ny klinisk enhet: den lille fiber nevropati. Flere internasjonale grupper demonstrerte foreningen mellom tap av intraepidermal nervefibre og symptomer/tegn på liten fiber nevropati5 av huden biopsi analyse og gitt standardiserte protokoller for nerve morphometry samt normative referanseverdier som skal brukes i klinisk praksis6,7,8.
Nylig en stor mengde bevis har vist at nevrodegenerative sykdommer, karakterisert ved misfolded protein ansamlinger i sentralnervesystemet, er multi-system patologi9. Faktisk er PD preget av αSyn akkumulering i den dopaminerg Nevron av substantia Nigra, men det har blitt demonstrert at αSyn og patologisk form, fosforylert ΑSyn (P-αSyn), kunne oppdages også i perifere vev. Gastro-intestinal mucosa10, spyttkjertler11, huden autonome fibre rundt svette kjertler og pilomotor muskler12,13,14, Vis immunoreactivity til patogene former for αSyn, i samsvar med Braak hypotese som intriguingly postulatet at αSyn patologi kan begynne i PNS i god tid, før akkumulering i hjernen15. Videre, tilstedeværelsen av p-αSyn har blitt demonstrert i huden nerver av pasienter med REM atferd lidelser som anses prodromal PD16,17 dermed huden patologisk αSyn kan betraktes som en lovende tidlig perifer histopathological markør for synucleinopathy.
Foreningen av små fiber nevropati i PD har blitt demonstrert tidligere, og det har blitt funnet at intraepidermal nervefibre tetthet reflekterer sykdomsprogresjon18,19. Derfor er huden biopsi et nyttig verktøy for å studere neurodegeneration i PD og for å etablere en pre-obduksjon histopathological diagnose av sykdommen. Faktisk, hud biopsi har en stor fordel av å være en lett tilgjengelig og minimalt invasiv prosedyre, slik at analysen av nervøse vev utsatt for patologi. Til slutt, muligheten for å gjenta huden biopsi i løpet av oppfølging av de samme pasientene kan studere langsgående korrelasjon med sykdomsprogresjon.
I vårt laboratorium, utnytte en dobbel Immuno-farging med PGP 9.5 og konformasjon spesifikke monoklonale 5G4 antistoff, som gjenkjenner sykdom spesifikke former for αSyn inkludert små aggregater20,21, kunne vi vise tilstedeværelsen av αSyn aggregater i huden nerver med en lovende høy diagnostisk effektivitet19. Immunofluorescence analyse av huden biopsi i conformational sykdommer skiller seg ut som en lovende kilde til biomarkører ved å kombinere både påvisning av protein aggregater og mål på neurodegeneration in vivo. Heretter illustrerer vi en enkel og allsidig protokoll om håndtering av huden biopsi og utføre fri-flytende immunofluorescence farging for å oppdage αSyn aggregater. Videre kan denne protokollen bli tilpasset for å målrette andre protein av interesse uttrykt i huden PNS.
Følgende studie protokoll har blitt brukt til å evaluere diagnostisk nytte av aggregert αSyn analyse i PNS av PD av huden biopsi19. Inkludering kriterier for PD var: en klar klinisk diagnose i henhold til UK Brain bank diagnostiske kriterier, sykdom varighet minst 3 år, ingen slektshistorie, og ingen større kognitiv svekkelse eller store dysautonomic symptomer i historien. Utelukkelse kriterier ble kjent årsaker til nevropati (glykosylert hemoglobin, kreatinin, vitamin B12, TSH, serum immun fikserings, HIV, HCV, syfilis, og borreliose). Hvert emne gjennomgikk 3 mm-diameter hud biopsier på tre anatomiske områder (halsen på C8 dermatomal nivå, lår 10 cm over kneet, etappe 10 cm over lateral Malleolus) på siden, som var klinisk mer berørt. Generelt, er følgende protokoll om håndtering av huden biopsi og utføre fri-flytende immunofluorescence farging og analyse. Derfor kan det tilpasses og brukes for påvisning av andre proteiner av interesse for hud vev.
Vi beskriver en fri-flytende immunofluorescence analysen for hud biopsier for diagnostisering av PD: den utnytter dobbelt immunostaining med anti-PGP 9.5 antistoff, en panaxonal markør, og anti-5G4, en konformasjon bestemt antistoff som anerkjenner aggregert form av αSyn.
De store fordelene med hud biopsi for diagnostiske formål i PD og muligens i andre protein conformational lidelser er: 1) direkte tilgang til nervøs vev utsatt for sykdom ved en mildt invasiv teknikk og dermed med en forv…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Parkinson Schweiz og ABREOC (Forskningsrådet for vitenskapelig forskning i Ente Ospedaliero Cantonale) for deres økonomiske støtte til denne studien.
5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2mg/ml |
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2mg/ml |
Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | |
Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |