이 프로토콜은 두개골 외상성 뇌 손상의 마우스 모델과 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 세포의 이식에 대한 방법론을 상해 부위내로 시연한다. 이 절차에서 결과의 행동 그리고 조직학 시험은 또한 간략하게 기술됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
외상성 뇌 손상 (TBI)은 전 세계적으로 사망률과 사망률의 주요 원인입니다. TBI로 인한 질병 병리학은 원발성 기계적 모욕에서 사멸 및 염증을 포함한 이차 상해 과정으로 진행됩니다. 동물 모델링은 부상 메커니즘을 해명하고 잠재적인 신경 보호 요법을 평가하기 위한 검색에서 가치가 있습니다. 이 프로토콜은 초점, 개방 헤드 TBI의 제어 된 피질 충격 (CCI) 모델을 설명합니다. 구체적으로, 온화한 일방적 인 피질 손상을 제조하기위한 매개 변수가 설명되어 있습니다. CCI의 행동 결과는 양측 감각 운동 통합의 접착제 테이프 제거 테스트를 사용하여 분석됩니다. TBI 병리학을 위한 실험적인 치료에 관하여, 이 프로토콜은 또한 두뇌로 배양된 세포를 이식하는 프로세스를 보여줍니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSCs)로부터 유래된 신경 세포 배양은 인간 TBI 환자에서 우수한 기능성 회복을 보여줄 수 있는 잠재력을 위해 선택되었다. 숙주 마우스 뇌 조직에서 hiPSCs의 만성 생존은 변형된 DAB 면역조직화학 적 과정을 사용하여 검출된다.
서론
외상성 뇌 손상 (TBI)은 간접적인 기계적 힘 (회전 가속 / 감속 또는 콘트라 쿠데타)으로 인해 뇌에 획득 된 부상에 대한 일반적인 용어입니다. TBI는 세계적인 죽음의 대략 9%의 원인으로 추정되고 1,2년 당 추정된 5천만의 케이스에서 관찰되었습니다. 질병 통제 예방 센터의 2017 년 보고서에 따르면 2013 년에 미국에서 TBI로 인한 총 280 만병원 방문 및 사망자가 3. 많은 온화한 TBCIs는 매년 보고되지 않습니다. 심각한 TBI인식, 운동 기능 및 전반적인 삶의 질의 평생 손상으로 이어질 수 있습니다. 온화한 TBI의 결과, 특히 반복적인 스포츠 관련 TBI는, 그들의 교활한 건강 효력4,5에대해서만 최근에 평가되었습니다 .
전임상 모델링은 TBI에 대한 새로운 기계론적 통찰력과 잠재적인 회복 요법을 개발하는 데 필수적인 요소입니다. TBI의 제어 된 피질 충격 (CCI) 모델은 피질에 기계적 타박상 부상의 오픈 헤드 모델입니다. 충격 매개 변수는 온화한에서 가혹한 6에 ....
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프로토콜
이 프로토콜에 설명된 모든 실험은 제복 서비스 대학 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 두개골 절제술 및 통제 된 피질 영향
- 제어 된 피질 충격 장치 및 수술 용품의 준비.
- 상처 관개를 위해 0.5 mL의 멸균 식염수로 1 mL 슬립 팁 주사기를 적재하십시오. 관개를 제어하기 위해 주사기에 25G 바늘을 부착하십시오.
- 1 mg/mL의 최종 농도에 DMSO에서 CsA의 희석 용액을 준비합니다. 면역 억제를 위해 0.5 mL의 사이클로스포린 A (CsA) 용액으로 두 번째 1 mL 슬립 팁 주사기를 로드하십시오. CsA 주사기에 25G 바늘 이상을 부착합니다.
- 제어된 피질 충격 피스톤을 스테레오탁스 프레임의 팔에 부착하고 15°의 각도로 설정합니다. 3mm 충격기 프로브를 피스톤에 부착합니다.
- 충격 속도를 1.5m/s로 설정하고 충격 거주 시간을 0.1s로 설정하여 가벼운 피질 손상을 일으킵니다.
- 일방적 인 두개골 절제술을 수행
- 압축 산소 소스와 이소플루란 기화기에 연결된 마취 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. ~0.7 L /min 산소에서 ~ 3 % 이소플루란으로 마취를 유도....
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결과
두개골 절제술 수술은 실험적인 뇌 손상 및 치료 세포 이식을 용이하게합니다 : 뇌 손상및 후속 세포 이식 치료의 제어 된 피질 충격 모델은 오버 레이리 두개골의주의 깊은 제거가 필요합니다. 두개골 절제술은 관심있는 뇌 영역에 조작을 허용하기 위해 두개골의 등받이 표면에서 수행 될 수있다. 그림 1의 다이어그램은 1차 체감각 및 모터 코르티케를 밝히기 위해 5mm 직경의 두개골 절제술 도식을 묘사합니다(그림1A). 두개골 절제술 후 24 시간에서, 두 번째 수술은 피질의 깊은 층으로 인간 iPSC 유래 신경 세포 현탁액을 주입하기 위해 수행되었다 (그림1B). 몇몇 대뇌 부종은 두개골 절제술 다음 날에, 특히 CCI 후에 정상입니다. 그러나, 이 절차의 모든 단계 도중 대뇌 혈관 절.......
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토론
실험적인 재생 요법을 테스트하기 위한 모델 시스템으로서 온화한 CCI
CCI 모형은 피질에 기계적인 상해 후에 조직 역기능의 기계장치를 조사하기 위한 귀중한 공구입니다. 부상 매개 변수의 튜닝성은 이 모델의 매력적인 특징입니다. 충격의 Z 깊이를 변경, 속도, 또는 거주 시간은 조사자10,25에의해 원하는대로 부상의 심각도를 증가 또는 감소 시킬 수 있습니다. 불착뇌 손상의 온화한 CCI 모형은, 제대로 수행될 때, 겸손한 피질 세포 죽음 및 최소한의 캐비테이션을 일으키는 원인이 되어야 합니다. 두개골 절제술과 두개골 플랩 제거는 세심한주의를 기울여 수행해야합니다. craniectomy 트렌치를 드릴링하는 동안 과도한 하향 힘이 가해지면 가열 및 진동으로 인해 피질 손상을 일으킬 수 있습니다. 두개골 플랩 제거 중 경막미의 기계적 중단은 거의 균일하게 심각한 피질 손상을 예측합니다. 주요 .......
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공개 사항
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 신경 과학 및 재생 의학 센터 (CNRM, 교부금 번호 G170244014)의 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 접착제 제거 파일럿 연구에서 마히마 듀완과 클라라 셀브레데의 도움을 주셔서 감사합니다. Kryslaine Radomski는 예비 뇌 손상 및 세포 이식 수술을 수행했습니다. USU CNRM 전임상 연구 핵심 실험실의 아만다 푸와 로라 터커는 동물 수술 및 행동 테스트에 대한 귀중한 조언을 각각 제공했습니다.
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재료
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| ml 주사기 | Becton Dickinson (BD) | ||
| 1.7 ml 플립 탑 테스트 튜브 | Denville | C2170 | |
| 10 마이크로리터 주사기 | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide 주사기 바늘 | Becton Dickinson (BD) | ||
| 70% 에탄올 | 선택 제품; 지역에 따라 다름 | ||
| 아세트아미노펜 경구 현탁액 | 타이레놀 (어린이용) | 에서 1 mg/ml로 희석 | |
| Vetland | 521-11-22 | ||
| 동물 취급 천 | 백화점에서 구매 | ||
| Betadine | Purdue 제품 | NDC-67618-151-32 | |
| 압축 산소 | 선택 제품; 지역에 따라 다름 | ||
| cyclosporine A | 시그마-알드리치 | 30024-100mg | |
| DAB 염색 키트 | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| 디메틸 설폭시드 (DMSO) | 시그마 알드리치 | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| 당나귀 안티 마우스 IgG 항체, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| 전기 테이프 | 3M Corporation | 백화점에서 구매 | |
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참고문헌
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al.
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재인쇄 및 허가
