Høy-gjennomstrømning DNA plasmider multipleksing og Transfeksjoner bruke akustisk Nanodispensing teknologi

Summary

Denne protokollen beskriver høy gjennomstrømming plasmider transfeksjoner av pattedyrceller i en 384-brønn plate ved hjelp av akustisk dråpe utstøting teknologi. Den tidkrevende, feilutsatte DNA-uttaket og-multipleksing, men også den transfeksjoner reagens uttaket, er programvare drevne og utføres av en nanodispenser enhet. Cellene blir deretter sådd i disse forhåndsutfylte brønnene.

Abstract

Cell transfeksjoner, uunnværlig for mange biologiske studier, krever kontrollerende mange parametre for en nøyaktig og vellykket prestasjon. Oftest utføres ved lav gjennomstrømning, er det dessuten tidkrevende og feil utsatt, enda mer når multipleksing flere plasmider. Vi utviklet en enkel, rask og nøyaktig metode for å utføre celle transfeksjoner i en 384 brønn plate layout ved hjelp av ADE-teknologi (akustisk dråpe utstøting). Den nanodispenser enheten som brukes i denne studien er basert på denne teknologien og gir presis nanovolume levering i høy hastighet fra en kilde brønn plate til en destinasjon en. Det kan dispensere og multiplex DNA og transfeksjoner reagens i henhold til et forhåndsutformet regneark. Her presenterer vi en optimal protokoll for å utføre ADE-baserte høykapasitets plasmider transfeksjoner som gjør det mulig å oppnå en effektivitet på opptil 90% og en nesten 100% cotransfection i cotransfection eksperimenter. Vi utvider innledende arbeid ved å foreslå en brukervennlig, regneark BAS ert makro som kan håndtere opptil fire plasmider/brønner fra et bibliotek som inneholder opptil 1 536 forskjellige plasmider, og et nettbrettbasert pipettering førings program. Makroen utformer de nødvendige malene for kildeplaten (e) og genererer filer som er klare til bruk for nanodispenser og nettbrettbasert program. De fire-trinn transfeksjoner protokollen innebærer i) en fortynningsvæske dispensere med en klassisk flytende handler, II) plasmider distribusjon og multipleksing, III) en transfeksjoner reagens dispensere av nanodispenser, og IV) celle plating på ferdigfylt brønner. Den beskrevne programvarebasert kontroll av ADE-plasmider multipleksing og transfeksjoner gjør at selv nonspecialists i felten kan utføre en pålitelig celle transfeksjoner på en rask og sikker måte. Denne metoden muliggjør rask identifisering av optimale innstillinger for en gitt celle type og kan forandres til høyere skala og manuelle tilnærminger. Protokollen Letter søknadene, som Human ORFeome protein (sette av åpen lesing rammens [ORFs] inne en Genova) gjengivelsen eller CRISPR-Cas9-basert gen funksjonen godkjenningen, inne nonpooled screening strategisk.

Introduction

Metoden som presenteres her beskriver i detalj hvordan man utfører DNA plasmider multipleksing og transfeksjoner i pattedyrceller ved høy gjennomstrømning ved hjelp av en akustisk-basert væske nanodispenser i en 384-brønn plate, selv for nonspecialists i feltet. Denne nylig publiserte metoden¹ gjør det mulig å utføre så mye som 384 uavhengige plasmider DNA-multipleksing og transfeksjoner forhold i ett eksperiment, på mindre enn 1 time. enkle eller cotransfection eksperimenter var vellykkede, og nådde en nær 100% cotransfection innenfor transfekterte celler befolkningen. Denne protokollen gjør transfeksjoner enklere fordi de fleste av de kjedelige, tidkrevende og feilutsatte trinnene nå er programvare drevne (se figur 1 for en generell oversikt). Det er gjort ytterligere anstrengelser for å utvikle dedikerte verktøy for å forbedre brukervennligheten og samtidig unngå menneskelige feil under den generelle prosessen og for å fremme vellykket transfeksjoner selv for nonspecialists i felten. Den beskrevne protokollen inkluderer en “brukervennlig” makro regneark som vi utviklet for å administrere 384 uavhengige transfeksjoner forhold med multipleksing muligheter på opptil fire plasmider i hver brønn. Makroen automatisk utvikler mal av kilden tallerken () å belaste det ventet DNA plasmider kvantum fra igangsetting lager løsninger og filene krevde å kjøre det nanodispenser programvare på eksperimentelle tegning det er blitt angitt. Siden den manuelle uttaket av DNA i en 384 kilde plate er kjedelig og utsatt for feil, har vi også utviklet en dedikert nettbrettbasert applikasjon som veileder brukeren under uttaket av DNA-løsningen i henhold til malen.

Figur 1: eksperimentell arbeidsflyt. Skjematisk representasjon av den optimale automatiserte høy gjennomstrømming Reverse transfeksjoner protokoll (fra eksperimentell design til tilpassede biologiske analysen). Manuelle trinn indikeres av hånd symbolet, og omtrentlig tid for hvert trinn er skrevet i en rød boks. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mange celle-baserte eksperimenter starter med plasmider DNA transfeksjoner, og selv om mange dedikerte reagenser har vært og fortsatt er under utvikling for å forbedre transfeksjoner effektivitet og/eller lette prosedyren, gjenstår mye å gjøre^{2,3 , 4}. DNA plasmider celle transfeksjoner innebærer flere trinn for å nå høy effektivitet, for eksempel en innledende komplekse opptak, endosomal rømme, og cytoplasmatiske transport til nucleus^5,6. I tillegg til kalsium nedbør eller fysiske teknikker som electroporation eller microinjection bruker dedikerte enheter⁷, moderne kjemiske metoder har fokusert på å forbedre DNA celle levering mens senke celle cytoxicity^{8, 9}i. Bruken av lipider eller kationiske polymerer som danner liposome komplekser og, mer nylig, har nonliposomal polymer kjemi systemer gjort transfeksjoner enklere og mer effektiv¹⁰. Til tross for denne utviklingen, krever celle transfeksjoner fortsatt spesifikke ferdigheter for å være nøyaktig utført som de fleste av disse fysiske eller kjemiske transfeksjoner protokoller krever forskere å manuelt forberede hver DNA transfeksjoner reaksjons tilstand, og dermed svekke gjennomstrømming. For å omgå dette problemet har omvendt transfeksjoner protokoller blitt utviklet ved hjelp av kjemiske transfeksjoner reagenser¹¹,^12,13, slik at brukeren kan teste eller kombinere flere plasmider på en raskere måte. I disse protokollene dannes nukleinsyre syre komplekser med transfeksjoner reagenser før seeding cellene i komplekser. Imidlertid er disse omvendte protokoller fortsatt begrenset av manuell håndtering av DNA-løsninger og ved kombinasjonen av hver av de selvstendige forhold. Selv om det er mulig å utføre dem i en 96-brønn plateformat, vil DNA-preparatet og utleverer være kjedelige, og det vil trolig være feil. Når ulike mengder av flere DNA plasmider er nødvendig og multiplekset med hverandre, celle transfeksjoner blir enda vanskeligere å oppnå og mer tidkrevende, og menneskelige feil blir ganske uunngåelig. Skalering opp til 384-brønn plateformat i en omvendt transfeksjoner tilnærming, til tross for få multiplekset DNA transfeksjoner forhold, blir en umulig utfordring på grunn av følgende årsaker. i) volumene av DNA-mengder, transfeksjoner reagens eller reaksjons blanding er lavere enn 1 μL for hver brønn. II) multipleksing av plasmider for 384 selvstendige forhold blir ekstremt komplisert. Leveransen i hver av 384 brønner er også III) svært tidkrevende og IV) utsatt for feil. Faktisk, utlevering den riktige løsningen i de forventede brønnene er vanskelig å håndtere fordi de lave volumene som allerede er utlevert ikke tillater visuell overvåkning mellom de tomme og allerede fylte brønner. v) til slutt, det er en høy risiko for tørking av blandingen ved fordampning før cellene tilsettes på grunn av den tiden som trengs for å utføre de nødvendige dispenser trinnene. Oppsummert, den begrensende faktoren for å sette opp høy gjennomstrømming DNA plasmider transfeksjoner analyser synes å være miniatyrisering av analysen, som innebærer lavt volum multipleksing og styring som ikke kan håndteres manuelt lenger, men er også neppe oppnåelig i en pålitelig måte av klassisk peristatic flytende handlers.

Som et bevis på problemer med å automatize slike analyser og få høy gjennomstrømming, bare noen forsøk på å automatisere transfeksjoner har blitt publisert så langt: en 96-brønn plateformat ved hjelp av en kommersiell væske håndteringsenhet og kalsium fosfat nedbør¹⁴ og, mer nylig, en lipoplex reagens, og en mikrovæskebasert chip muliggjør 280 uavhengige transfections¹⁵ men krever spesialiserte ferdigheter på dette feltet. En annen metode, acoustophoresis, slik at flytende Levitation og fører til væske manipulasjon og miksing, ble brukt til å utføre DNA transfeksjoner i 24-til 96-brønn plateformater¹⁶. Til tross for gjennomførbart, denne adgang lide fra en ytterst lav produksjon idet det blander av celler med DNA transfeksjoner blanding behøver en 60 s inkubasjons for enhver enkelt punkt tidligere seeding. Dette innebærer en varighet på minst 96 min for en komplett 96-brønn plate. Videre er denne protokollen langt unna å være mottagelig for den samlede biologer ‘ publikum som dette arbeidet ble gjort med en in-House designet og produsert enhet som for øyeblikket ikke er tilgjengelig på markedet. Tvert imot, i de siste årene, en lett å bruke programvare drevet akustisk-basert dispenser teknologi har dukket opp med nanovolume dispenser enheter. Ved hjelp av fokusert akustisk energi, disse enhetene lar tett kontrollert utstøting av små flytende volumer fra 2,5 nL til 500 nL fra en kilde plate til en destinasjon en¹⁷. Denne teknologien, kalt akustisk dråpe utstøting (ADE), har mange fordeler: den er helautomatisk, kontaktløse, tipless, nøyaktig, presis og svært reproduserbar, og den har en høy gjennomstrømming på¹⁸. Først viet til å levere dimethyl sulfoxide (DMSO) løsninger, har innstillingene blitt forbedret for å dispensere vandige buffere¹⁹. Akustisk nanodispensers, så synes egnet for omvendt celle transfeksjoner protokoller og kunne omgå de fleste av de nevnte manuelle begrensninger. Siden ingen plasmider transfeksjoner forsøk tidligere ble beskrevet ved hjelp av denne teknologien, har vi nylig evaluert egnetheten av et akustisk BAS ert doseringssystem for å utføre omvendt celle transfeksjoner.

Dra nytte av nanodispenser gjennomstrømning og brukervennlighet, optimalisert vi en omvendt transfeksjoner protokoll for HeLa celler ved kryss-testing flere parametre som kan påvirke DNA transfeksjoner på en 384-brønn, enkelt plate, nemlig den totale DNA-beløpet og av kilde DNA, start konsentrasjon, fortynnings volum, transfeksjoner reagens og antall sprednings celler. Den utviklede protokollen omgår de ovennevnte manuelle begrensningene av celle transfeksjoner og presenterer flere fordeler fremfor andre automatiserte transfeksjoner forsøk. Først er det miniatyriserte, og dermed gir for kostnadseffektiv transfeksjoner reagens ved å spare DNA plasmider preparater og transfeksjoner reagens. Dernest er det mye mer høy gjennomstrømming og reproduserbar enn den manuelle protokollen (selv for nybegynnere), som transfeksjoner av en hel 384-brønn plate kan oppnås på mindre enn 1 t. Til slutt er det programvare drevet, slik at kontroll av det utlevert DNA-beløpet og multipleksing av flere plasmider. Takket være den nanodispenser programvaren (tabell over materialer), kan brukeren faktisk utarbeide en studieplan for å kontrollere volumene som skal føres ut fra en definert kilde brønn plate til en destinasjon.

Protokollen som presenteres her er i hovedsak ment for de som har tilgang til en nanodispenser og ønsker å sette opp transfeksjoner eksperimenter med høy gjennomstrømming, men også for de som ønsker å raskt optimalisere sine transfeksjoner parametere for en gitt celle type ved bruke denne protokollen til å kryss-teste flere parametere med høy gjennomstrømming. Vi har faktisk vist at optimaliserte parametre identifisert med denne nanoskala protokollen kan forandres til større skala og manuelle transfeksjoner eksperimenter. Til slutt, som transfeksjoner reagens som brukes i den foreliggende protokollen tillater DNA eller siRNA transfeksjoner i henhold til produsenten, er protokollen også av interesse for de som sikter på å utføre array tilnærminger for gen overuttrykte eller knockdown. Destinasjons platene forhåndsutfylt med DNA kan bevares inntil 7 dager før bruk i en transfeksjoner analyse uten tap av effekt, noe som er en annen fordel med følgende protokoll for denne typen program.

Protocol

1. Advance forberedelser Utarbeidelse av peristaltisk flytende handler programmerMerk: for fortynnings-og celle doserings trinnene i protokollen, må et dedikert program være forberedt, og ta hensyn til høyden på uttaket til platen som brukes og skritt intensjonen. For 1 μL fortynningsvæske trinn monterer du en 1 μL kassett og klargjør et program med innstillingene som beskrevet i trinn 1.1.1.1 og 1.1.1.2. Juster flow rate parameteren til høy for bes…

Representative Results

fIn for å avgjøre om ADE-teknologien kan brukes til en automatisert omvendt transfeksjoner-protokoll, overvåket vi celle transfeksjoner effektivitet ved fluorescens mikroskopi, ved hjelp av en rød fluorescerende tdTomato som uttrykker plasmider. Først sikter på å bestemme de beste transfeksjoner parametrene, ulike fortynnings volumer og totale mengder DNA var kryss-testet. Fortynnings volum ble brukt til å tillate DNA-dråpene, en gang utlevert, å spre over hele brønnene for å …

Discussion

Etablering og optimalisering av en nøyaktig høy gjennomstrømming transfeksjoner metode for en gitt cellelinje krever forskere til å følge noen viktige parametre som er beskrevet i denne delen. Vi oppfordrer sterkt starter med de anbefalte verdiene i hele protokollen som disse innstillingene optimalisert for jakten celler viste seg også å være effektiv for HEK celler. Men, som de beste parametrene kan avhenge av cellelinjer og transfeksjoner reagenser, kan optimale forhold defineres ved å variere celle nummer, fo…

Materials

384LDV Microplate	Labcyte	LP-0200
384-well Microplate μClear Black	Greiner	781906
Ampicilin	Sigma	A9393-5G	Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet	Samsung	Galaxy Note 8	used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29	Anios	2421073	disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software	Perkin Elmer		image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10566032	cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software	Labcyte		Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550	Labcyte		ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	to fix cell
HeLa cells	ATCC	HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570	10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000	GE Healthcare	29043323	automated laser-based confocal imaging platform
LB medium	Thermoischer Scientific LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder	12780052	culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)	Macherey-Nagel	740912.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette	Biotek Instruments Inc	7170013	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette	Biotek Instruments Inc	7170012	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser	Biotek Instruments Inc	7171000	peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer	Denovix	DS-11 Spectrophotometer	Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid	mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid		Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)	Macherey-Nagel	740913.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit	Macherey-Nagel	740588.50	used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4)	Macherey-Nagel	740914.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker	incubated large capacity shaker	444-7084	Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	10010001
Plasmid mini-columns	Macherey-Nagel	740499.250	Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)	Macherey-Nagel	740911.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A	Macherey-Nagel	740505	Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid	Addgene	Plasmid #54642	Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato
TransIT-X2 Dynamic Delivery System	Mirus Bio	MIR 6000
Wash Buffer (AW)	Macherey-Nagel	740916.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer	Creality	CR10S	used to print the plate adapter
Blender Software	https://www.blender.org/ Free software under GNU General Public License (GPL).	version 2.79b	used to design the plate adapter