이 프로토콜은 음향 액적 배출 기술을 사용하여 384 웰 플레이트에서 포유류 세포의 고처리량 플라스미드 형질 감염을 설명합니다. 시간이 많이 소요되고 오류가 발생하기 쉬운 DNA 디스펜싱과 트랜스펙션 시약 디스펜싱은 나노 에스터디터 장치에 의해 소프트웨어 구동 및 수행됩니다. 세포는 다음 이 미리 채워진 우물에서 파종됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
많은 생물학적 연구에 필수적인 세포 형질감염은 정확하고 성공적인 성취를 위해 많은 매개 변수를 제어해야 합니다. 대부분의 경우 낮은 처리량에서 수행, 그것은 또한 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉬운, 더 많은 그래서 여러 플라스미드를 다중화 할 때. 우리는 음향 액적 배출 (ADE) 기술을 사용하여 384 웰 플레이트 레이아웃에서 세포 변환을 수행하는 쉽고 빠르며 정확한 방법을 개발했습니다. 본 연구에 사용되는 나노 디스펜서 장치는 이 기술을 기반으로 하며 소스 웰 플레이트에서 대상 플레이트까지 고속으로 정밀한 나노부피 전달을 허용합니다. 미리 디자인된 스프레드시트에 따라 DNA 및 트랜스펙트 시약을 분배하고 분배할 수 있습니다. 여기에서 우리는 최대 90%의 효율과 cotransfection 실험에서 거의 100%의 연전율에 도달할 수 있게 하는 ADE 기반고처리량 플라스미드 형혈을 수행하기 위한 최적의 프로토콜을 제시합니다. 사용자 친화적인 스프레드시트 기반 매크로를 제안하여 최대 1,536개의 플라스미드를 포함하는 라이브러리에서 최대 4개의 플라스미드/웰을 관리할 수 있으며 태블릿 기반 파이펫팅 가이드 응용 프로그램을 제안하여 초기 작업을 확장합니다. 매크로는 소스 플레이트의 필요한 템플릿을 설계하고 나노 디스펜서 및 태블릿 기반 응용 프로그램에 대한 즉시 사용 파일을 생성합니다. 4단계 형질전환 프로토콜은 i) 고전적인 액체 처리기를 가진 희석제 디스펜스, ii) 플라스미드 분포 및 멀티플렉싱, iii) 나노디스펜서에 의한 트랜스펙션 시약 디스펜스, 및 iv) 미리 채워진 웰상에서의 세포 도금과 관련이 있다. ADE 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션의 기술된 소프트웨어 기반 제어를 통해 현장의 비전문가조차도 빠르고 안전한 방법으로 신뢰할 수 있는 세포 형질변환을 수행할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 지정된 셀 유형에 대한 최적의 설정을 신속하게 식별할 수 있으며 더 높은 규모및 수동 접근법으로 전환할 수 있습니다. 이 프로토콜은 비풀스닝 전략에서 인간 ORFeome 단백질(게놈에서 열린 판독 프레임 [ORFs] 세트) 발현 또는 CRISPR-Cas9 기반 유전자 기능 유효성 검사와 같은 응용을 용이하게 합니다.
서론
여기에 제시된 방법은 384웰 플레이트에서 음향 기반 액체 나노디스터를 사용하여 높은 처리량에서 포유류 세포에서 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션을 수행하는 방법을 자세히 설명하며, 심지어 현장의 비전문가를 위한 것입니다. 이 최근 발표된 방법 1은 한 실험에서 384개의 독립적인 플라스미드 DNA 다중화 및 형질전환 조건을 1시간 미만으로 수행할 수 있게 해주며, 단일 또는 배전 실험이 성공하여 거의 100%에 이르렀습니다. 형질 감염된 세포 집단 내의 환전. 이 프로토콜은 지루하고 시간이 많이 소요되며 오류가 발생하기 쉬운 대부분의 단계가 이제 소프트웨어 기반이기 때문에 더 쉽게 변환할 수 있습니다(일반적인 개요의 경우 그림 1 참조). 또한 전체 프로세스 중에 사람의 실수를 피하면서 사용 편의성을 높이고 현장의 비전문가에게도 성공적인 트랜스펙션을 촉진하기 위한 전용 도구를 개발하기 위해 더욱 노력했습니다. 설명된 프로토콜에는 384개의 독립적인 형질감염 조건을 관리하기 위해 개발한 "사용자 친화적인" 매크로 스프레드시트가 포함되어 있으며, 각 우물에서 최대 4개의 플라스미드의 다중화 가능성이 있습니다. 매크로는 소스 플레이트의 템플릿을 자동으로 생성하여 시작 스톡 솔루션에서 예상되는 DNA 플라스미드 볼륨....
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프로토콜
1. 사전 준비
- 연동 액 처리기 프로그램의 준비
참고: 프로토콜의 희석제 및 셀 디스펜싱 단계의 경우 사용된 플레이트에 대한 디스펜싱 헤드의 높이와 단계 의도를 고려하여 전용 프로그램을 준비해야 합니다.- 1 μL 희석제 디스펜스 단계의 경우, 1 μL 카세트를 장착하고 1.1.1.1 및 1.1.2 단계에 설명된 대로 설정이 있는 프로그램을 준비한다.
- 이 단계에서 생물학적 물질 손상이 예상되지 않는 최상의 처리량을 위해 유량 파라미터를 높음으로 조정합니다. 디스펜스 높이를 9.6 mm로 조정(사용된 세포 배양판에 따라, 보충 도1)을 1 μL 드롭이 경륜의 시대에 우물의 바닥에 닿을 수 있도록 한다.
참고: 이 단계는 떨어뜨릴 수 있는 충분한 양에 도달할 때까지 디스펜싱 헤드에 액적의 유지를 방지하는 데 중요합니다. - 각 행을 분배한 후 플레이트 위에 디스펜싱 헤드를 자유롭게 변위할 수 있도록 플레이트 클리어 높이를 14.4mm로 조정합니다. 연동 액상 핸들러 헤드 높이의 적절한 설정을 시각적으로 제어: 디스펜싱 하는 동안 디스펜싱 팁에 방울이 유지되지 않도록 하고 각 행을 분배한 후 헤드가 충분히 높은지 확인하십시오.
참....
- 이 단계에서 생물학적 물질 손상이 예상되지 않는 최상의 처리량을 위해 유량 파라미터를 높음으로 조정합니다. 디스펜스 높이를 9.6 mm로 조정(사용된 세포 배양판에 따라, 보충 도1)을 1 μL 드롭이 경륜의 시대에 우물의 바닥에 닿을 수 있도록 한다.
- 1 μL 희석제 디스펜스 단계의 경우, 1 μL 카세트를 장착하고 1.1.1.1 및 1.1.2 단계에 설명된 대로 설정이 있는 프로그램을 준비한다.
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결과
fADE 기술이 자동 역형질 감염 프로토콜에 사용될 수 있는지 확인하기 위해 적색 형광 tdTomato 발현 플라스미드를 사용하여 형광 현미경으로 세포 형질 전환 효율을 모니터링했습니다. 먼저 최고의 형질 감염 파라미터를 결정하는 것을 목표로, 다른 희석제 부피 및 DNA의 총 양은 교차 시험되었다. 희석제 부피는 DNA 방울이 일단 분배되면, 예비 실험에서 관찰된 불균일성 형란을 회피하기 위해 우물 전체에 퍼지도록 하는 데 사용되었다(즉, 우물의 중앙에만). 도 6A에도시된 바와 같이, 리포폴리플렉스 시약(20)을 이용한 헬라 세포의 형질전환이 성공적이었다. 흥미롭게도, 1 μL 희석제 부피를 사용하여, 5~30 ng에 이르는 DNA 양은 50 및 100 ng와 같은 더 높은 양에 비해 동일한 효율 및 최대 90%의 세포 형질변환을 보였으며, 이는 갑작스러운 감소가 관찰되었.......
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토론
주어진 세포주에 대한 정확한 고처리량 형벌 방법의 확립 및 최적화는 과학자들이 이 섹션에서 설명하는 몇 가지 주요 매개 변수를 따라야 합니다. HeLa 세포에 최적화된 이러한 설정도 HEK 세포에 대해 효율적이라는 것이 입증됨에 따라 프로토콜 전반에 걸쳐 권장값으로 시작하는 것이 좋습니다. 그러나, 최상의 파라미터는 세포주 및 형질감염 시약에 의존할 수 있기 때문에, 최적의 조건은 세포 수, 희석제 부피, 총 DNA 양 및 형질전환 시약 성질, 농도 또는 짝수 부피를 변화시킴으로써 정의될 수 있다. HeLa 셀에 대한 이 프로토콜의 최적화 중에 사례1.
여기에 제시된 전반적인 프로토콜은 현장에서 초보자도 세포 형질 감염이 허용되도록 개발되고 더욱 최적화되었습니다. 이 목표를 달성하기 위해 프로토콜을 가능한 한 간단하게 렌더링하고 사람의 실수를 피할 수있는 주요 도구가 개발되었습니다 : 실험을 쉽게 디자인할 수있는 사용자 친화적 인 스프레.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 이 문서의 연구, 저자 및/또는 출판에 대한 다음과 같은 재정적 지원의 영수증을 공개했다: Inserm, 릴 대학, 릴 파스퇴르 연구소, Conseil 레지오날 뒤 노르, PRIM-HCV1 과 2 (폴 드 레체 Interdisciplinaire sur le Médicament), 에이전시 내셔널 드 라 레체 (ANR-10-EQPX-04-01), 페더 (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) 및 유럽 공동체 (ERC-STG INTRACELLTB n° 260901). 저자는 원고의 비판적 검토와 수정에 대해 S. Moureu 박사, B. Villemagne 박사, R. 페루 클레멘트 박사, H. Groult 박사에게 감사를 표하고자 합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 384LDV 마이크로플레이트 | 랩사이트 | LP-0200 | |
| 384-웰 마이크로플레이트 μ 클리어 블랙 | Greiner | 781906 | |
| Ampicilin | Sigma | A9393-5G | 선택 암피실린 발현 벡터로 변형 된 박테리아에 대한 항생제 |
| 안드로이드 태블릿 | 삼성 | 갤럭시 노트 8 | 소스 플레이트 수동 분배 |
| Aniospray Surf 29 | Anios | 2421073 | 소독제 MicroFlo 헤드 |
| 콜럼버스 청소 소프트웨어 | Perkin Elmer | 이미지 분석 소프트웨어 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), 고포도당, GlutaMAX 보충제, 피루브산 | Thermo Fisher Scientific | , 10566032 | 배양 배지 |
| Echo Cherry Pick 1.5.3 소프트웨어 | Labcyte | *.csv 파일로부터 Echo550 장치에 의한 ADE 기반 디스펜싱을 가능하게 하는 소프트웨어, 나노 디스펜서 소프트웨어 | |
| Echo550 | Labcyte | ADE 기반 디스펜서 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 세포 배양 배지 |
| 포르말린 용액, 중성 완충액, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | 을 추가하여 세포 |
| HeLa 세포 | ATCC | HeLa(ATCC® CCL-2&무역;) | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | 10 mg/mL 용액 |
| INCell 분석기 6000 | GE Healthcare | 29043323 | 자동 레이저 기반 컨포칼 이미징 플랫폼 |
| LB medium | Thermoischer Scientific LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, 박테리아 | 성장을 | |
| 위한 분말 12780052 배양 배지용해 완충액 (A2) | Macherey-Nagel | 740912.1 | 에서 플라스미드를 준비하는 데 사용되는 NucleoSpin Plasmid 키트의 버퍼 |
| ; L 카세트 | Biotek Instruments Inc | 7170013 | Microflo 디스펜서 |
| MicroFlo 1&mu와 함께 사용하기 위해; L 카세트 | Biotek Instruments Inc | 7170012 | Microflo 디스펜서와 함께 사용 |
| MicroFlo 디스펜서 | Biotek Instruments Inc | 7171000 | 연동 펌프 기반 액체 처리기 장치 |
| Microvolume 분광 광도계 | Denovix | DS-11 분광 광도계 | 샘플의 DNA 농도 |
| 측정 mVenus 플라스미드 | mVenus cDNA는 tdTomato-N1 플라스미드의 Age1/BsrG1 부위에서 효소 제한 분해 및 결찰에 의해 클로닝되었습니다 | . 벡터 유형: 포유류 발현, 융합 단백질: mVenus | |
| Macherey-Nagel | 740913.1 | 박테리아 배양에서 플라스미드를 제조하는 데 사용되는 NucleoSpin Plasmid 키트의 버퍼 | |
| NucleoSpin Plasmid 키트 | Macherey-Nagel | 740588.50 | 박테리아 배양에서 플라스미드를 제조하는 데 사용 |
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| culture Resuspension buffer (A1) | Macherey-Nagel | 740911.1 | NucleoSpin Plasmid 키트에서 사용한 버퍼 세균 배양 |
| RNAse A | Macherey-Nagel | 740505 | Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture |
| tdTomato-N1 plasmid | Addgene | Plasmid #54642 | Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato |
| TransIT-X2 Dynamic Delivery System | Mirus Bio | MIR 6000 | |
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| 3D 프린터 | Creality | CR10S | 를 준비하는 데 사용 플레이트 어댑터 인쇄에 사용 |
| 블렌더 소프트웨어 | https://www.blender.org/ GNU General Public License(GPL)에 따른 무료 소프트웨어. | 플레이트 어댑터를 설계하는 데 사용되는 | 버전 2.79b |
참고문헌
- Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064(2018).
- Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
- Thermo Fisher Scientific.
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재인쇄 및 허가
