Высокопроизводительная ДНК плазменный мультиплексирование и трансфекция с использованием акустической технологии нанодозирования

Summary

Этот протокол описывает высокопроизводительную плазмидную трансфекцию клеток млекопитающих в 384-хорошую пластину с использованием акустической технологии выброса капель. Трудоемкий, подверженный ошибкам раздавливание ДНК и мультиплексирование, а также дозирование реагентов трансфекционного реагента, являются программным обеспечением и выполняются нанодайзером. Клетки затем посеяны в этих предварительно заполненных скважин.

Abstract

Трансфекция клеток, незаменимая для многих биологических исследований, требует контроля многих параметров для точного и успешного достижения. Чаще всего выполняется при низкой пропускной их, это к тому же трудоемкие и подверженные ошибкам, тем более при мультиплексации нескольких плазмидов. Мы разработали простой, быстрый и точный метод для выполнения трансфекции клеток в 384-хорошо макет пластины с использованием акустических капель катапульты (ADE) технологии. Устройство nanodispenser используемое в этом изучении основано на этой технологии и позволяет точно поставку nanovolume на высокой скорости от плиты скважины источника к назначению одному. Он может обойтись и мультиплекс ДНК и трансфекционного реагента в соответствии с заранее разработанной таблицы. Здесь мы представляем оптимальный протокол для выполнения ADE основе высокой пропускной способностью плазмидтранса, что позволяет достичь эффективности до 90% и почти 100% котрансфекции в котрансфекционных экспериментов. Мы расширяем первоначальную работу, предлагая удобный для пользователя макрос на основе электронных таблиц, способный управлять до четырех плазмидов/колодцев из библиотеки, содержащей до 1536 различных плазмидов, и приложения для планшетного нахлыстое направляющее приложение. Макрос разрабатывает необходимый шаблон (ы) исходной пластины (ы) и генерирует готовые к использованию файлы для нанодайзера и планшетного приложения. Четырехэтапный протокол трансфекции включает в себя i) разбавитель обойтись с классическим жидким обработчиком, ii) плазмидное распределение и мультиплексирование, iii) трансфекционный реагент распределяется нанодсером, и iv) клеточное покрытие на предварительно заполненных скважинах. Описанный программно-основанный контроль мультиплексирования и трансфекции Плазмидных плазмидных aDE позволяет даже неспециалистам в полевых условиях быстро и безопасно выполнять надежную трансфекцию клеток. Этот метод позволяет быстро определить оптимальные настройки для данного типа ячейки и может быть перенесен на более высокие и ручные подходы. Протокол облегчает применение, такие как человеческий белок ORFeome (набор открытых кадров чтения в геноме) или CRISPR-Cas9 на основе генной функции проверки, в непулированных стратегий скрининга.

Introduction

Представленный здесь метод подробно описывает, как выполнять мультиплексирование и трансфекцию ДНК в клетках млекопитающих при высокой пропускной состоянии с помощью жидкого нанодайзера на основе акустической системы в 384-хорошей пластине, даже для неспециалистов в этой области. Этот недавно опубликованный метод¹ позволяет выполнять столько, сколько 384 независимых плазмидных мультиплексирования ДНК и трансфекции условиях в одном эксперименте, менее чем за 1 ч. Одиночные или котрансфекционные эксперименты были успешными, достигнув почти 100% котрансфекция в популяции трансинфицированных клеток. Этот протокол упрощает трансфекцию, поскольку большинство утомительных, трудоемких и подверженных ошибкам шагов теперь ориентированы на программное обеспечение (см. рисунок 1 для общего обзора). Были предприняты дальнейшие усилия по разработке специализированных инструментов для повышения простоты использования при одновременном предотвращении человеческих ошибок в ходе общего процесса и содействия успешному трансфекции даже для неспециалистов в этой области. Описанный протокол включает в себя “удобную” макротаблицу, которую мы разработали для управления 384 независимыми трансфекционными условиями с мультиплексированием возможностей до четырех плазмидов в каждой скважине. Макрос автоматически генерирует шаблоны исходной пластины (ы) для загрузки ожидаемого объема плазмидной плазмы ДНК от стартовых фондовых решений и файлов, необходимых для привода программного обеспечения нанодайзера на экспериментальной конструкции, которая была введена. Поскольку ручная раздача ДНК в 384-хорошо источник пластины утомительно и подвержены ошибкам, мы также разработали специальное приложение на основе таблетки для руководства пользователя при распределении решения ДНК в соответствии с шаблоном.

Рисунок 1: Экспериментальный рабочий процесс. Схематическое представление оптимального автоматизированного протокола обратного трансфекции высокой пропускной связи (от экспериментального проектирования до пользовательского биологического асссе). Ручные шаги указаны символом руки, а приблизительное время для каждого шага написано в красной коробке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Многие клеточные эксперименты начинаются с плазмидной трансфекции ДНК, и даже если многие выделенные реагенты были и все еще разрабатываются для повышения эффективности трансфекции и / или облегчить процедуру, многое еще предстоит сделать^{2,3 , 4}. Трансфекция плазмидных клеток ДНК включает в себя несколько шагов для достижения высокой эффективности, таких как начальное комплексное поглощение, эндосомальный побег и цитоплазмический перенос к ядру^5,6. В дополнение к выпасам кальция или физическим методам, таким как электропорация или микроинъекция с использованием специальных устройств⁷, современные химические методы были сосредоточены на повышении доставки клеток ДНК при снижении цитоксичности клеток^{8, 9}. Использование липидов или катионных полимеров, образующих липосомы-подобные комплексы, а в последнее время нелипсоомальные полимерные химические системы сделали трансфекцию проще и эффективнее^10. Несмотря на эти изменения, трансфекция клеток по-прежнему требует конкретных навыков, которые должны быть точно выполнены, поскольку большинство из этих физических или химических протоколов трансфекции требуют, чтобы ученые вручную подготовить каждое состояние реакции трансфекции ДНК, таким образом ухудшает пропускную выливку. Чтобы обойти эту проблему, обратные протоколы трансфекции были разработаны с использованием химических реагентов трансфекции^11,12,13, что позволяет пользователю проверить или объединить несколько плазмидов в более быстрый способ. В этих протоколах перед посевом клеток на комплексах образуются нуклеиновые кислотные комплексы с трансфекционными реагентами. Однако эти обратные протоколы по-прежнему ограничены ручным управлением решениями ДНК и сочетанием каждого из независимых условий. Хотя это возможно, чтобы выполнить их в 96-ну хорошо пластины формате, подготовка ДНК и дозы будет утомительным, и там, вероятно, будут ошибки. Когда требуется различное количество нескольких плазмидов ДНК и мультиплексируется друг с другом, трансфекция клеток становится еще более трудной и более трудоемкой, и человеческие ошибки становятся совершенно неизбежными. Масштабирование до 384-колодцевого формата пластин в обратном подходе трансфекции, несмотря на несколько мультиплексированных условий трансфекции ДНК, становится невозможной задачей из-за следующих причин. i) Объемы ДНК, трансфективный реагент или объемы реакционной смеси для управления ниже, чем 1 КЛ для каждой скважины. ii) Мультиплексирование плазмидов для 384 независимых условий становится чрезвычайно сложным. Поставка в каждой из 384 скважин также iii) очень трудоемкие и iv) ошибка подвержена. Действительно, выдать правильное решение в ожидаемых скважинах трудно управлять, потому что низкие объемы уже обойтись не позволяют визуального мониторинга между пустыми и уже заполненными скважинами. v) Наконец, существует высокий риск высыхания смеси путем испарения до добавления клеток в связи со временем, необходимым для выполнения необходимых мер по дозированию. Таким образом, ограничивающим фактором для создания высокой пропускной днк плазмидных трансфекционных анализов, как представляется, миниатюризация анализа, который подразумевает малообъемный мультиплексирование и управление, которые не могут быть обработаны вручную больше, но также вряд ли достижимы в надежным способом классическими перистатическими жидкими обработчиками.

В качестве доказательства сложности автоматизировать такие assays и получить высокую пропускную стоимость, только несколько попыток автоматизировать трансфекции были опубликованы до сих пор: 96-ну хорошо пластины формат с использованием коммерческого устройства обработки жидкости и фосфата кальция осадков¹⁴ и, совсем недавно, липоплексрей, и микрофлюидный чип, позволяющий 280 независимых трансфекций^15, но требующих специальных навыков в этой области. Другой метод, акоутофорез, позволяющий жидкой левитации и ведущих к жидкости манипуляции и смешивания, был использован для выполнения трансфекции ДНК в 24-96-ну хорошо пластины форматов¹⁶. Хотя этот подход является осуществимым, он страдает от крайне низкой пропускной всей перевалки, поскольку смешивание клеток с трансфекционной смесью ДНК требует инкубации 60 с для каждой точки перед посевом. Это означает продолжительность не менее 96 мин для полной 96-колодца пластины. Кроме того, этот протокол далек от того, чтобы поддаваться общей аудитории биологов, как эта работа была сделана с в доме разработан и изготовлены устройства, которые в настоящее время не доступны на рынке. Напротив, в последние несколько лет с помощью нанообъемных диспенсеров появилась простая в использовании технология акустического дозирования на основе программного обеспечения. Используя сфокусированную акустическую энергию, эти устройства позволяют жестко контролируемый выброс небольших объемов жидкости от 2,5 нл до 500 нл от исходной пластины до пункта назначения^17. Эта технология, называемая акустической выкатывания капель (ADE), имеет множество преимуществ: она полностью автоматизирована, бесконтактная, без кончиков, точная, точная и высоко воспроизводимая, и имеет высокую пропускную связь¹⁸. Первый посвященный доставке диметилсульксида (DMSO) решения, настройки были расширены, чтобы обойтись aqueous буферов¹⁹. Таким образом, акустические нанодятелы, кажется, подходят для протоколов трансфекции обратных клеток и могут обойти большинство вышеупомянутых ручных ограничений. Поскольку с помощью этой технологии не было описано никаких попыток трансфекции плазмидных трансфекций, мы недавно оценили пригодность акустической системы дозирования для выполнения обратного трансфекции клеток.

Воспользовавшись пропускной стоимостью нанодчебирования и простотой использования, мы оптимизировали обратный протокол трансфекции для клеток HeLa путем перекрестного тестирования нескольких параметров, которые могут влиять на трансфекцию ДНК на 384-ну, одной пластине, а именно, общее количество ДНК и источник концентрации ДНК, разбавитель, трансфекционный реагент, и количество спреда клеток. Разработанный протокол обходит вышеописанные ручные ограничения трансфекции клеток и предоставляет ряд преимуществ по сравнению с другими автоматизированными попытками трансфекции. Во-первых, он миниатюризирован, что позволяет экономически эффективным трансфекционным реагентом, экономя препараты плазмида ДНК и трансфекционный реагент. Во-вторых, он гораздо более высокопроизводительен и воспроизводим, чем ручной протокол (даже для начинающих), так как трансфекция всей 384-й пластины может быть достигнута менее чем за 1 ч. Наконец, это программное обеспечение, что позволяет контролировать дозированных количество ДНК и мультиплексирования нескольких плазмидов. Действительно, благодаря программному обеспечению nanodispenser(Таблица материалов), пользователь может разработать план исследования для управления объемами, которые будут освобождены от определенного источника хорошо пластины назначения один.

Представленный здесь протокол предназначен в основном для тех, кто имеет доступ к нанодционизму и хотел бы создать трансфекционные эксперименты с высокой пропускной их пропускной вот и доступной, но также и для тех, кто хочет быстро оптимизировать свои параметры трансфекции для данного типа клеток применение этого протокола для перекрестного тестирования нескольких параметров при высокой пропускной состоянии. Действительно, мы показали, что оптимизированные параметры, идентифицированные с этим наномасштабным протоколом, могут быть перенесены в более масштабные и ручные трансфекционные эксперименты. Наконец, поскольку трансфекционный реагент, используемый в настоящем протоколе, позволяет трансфекцию ДНК или siRNA в соответствии с производителем, протокол также представляет интерес для тех, кто стремится к выполнению комплексных подходов к переэкспрессии генов или нокдауну. Назначения пластины предварительно заполнены ДНК могут быть сохранены до 7 дней до использования в трансфекционном анализе без потери эффективности, которая является еще одним преимуществом следующего протокола для такого рода применения.

Protocol

1. Предварительная подготовка Подготовка программ перистальтических жидкостных обработокПРИМЕЧАНИЕ: Для разбавитель ныхивательных и клеточных этапов протокола должна быть подготовлена специальная программа с учетом высоты дозирующей головки к используемой пласти?…

Representative Results

f Для того, чтобы определить, может ли технология ADE быть использована для автоматизированного протокола обратного трансфекции, мы отслеживали эффективность трансфекции клеток с помощью флуоресцентной микроскопии, используя красный флуоресцентный tdTomato, выражающий п…

Discussion

Создание и оптимизация точного метода трансфекции высокой пропускной связи для данной клеточной линии требует от ученых следовать некоторым ключевым параметрам, описанным в этом разделе. Мы настоятельно рекомендуем начать с рекомендуемых значений во всем протоколе, так как эти парам…

Materials

384LDV Microplate	Labcyte	LP-0200
384-well Microplate μClear Black	Greiner	781906
Ampicilin	Sigma	A9393-5G	Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet	Samsung	Galaxy Note 8	used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29	Anios	2421073	disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software	Perkin Elmer		image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10566032	cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software	Labcyte		Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550	Labcyte		ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	to fix cell
HeLa cells	ATCC	HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570	10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000	GE Healthcare	29043323	automated laser-based confocal imaging platform
LB medium	Thermoischer Scientific LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder	12780052	culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)	Macherey-Nagel	740912.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette	Biotek Instruments Inc	7170013	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette	Biotek Instruments Inc	7170012	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser	Biotek Instruments Inc	7171000	peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer	Denovix	DS-11 Spectrophotometer	Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid	mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid		Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)	Macherey-Nagel	740913.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit	Macherey-Nagel	740588.50	used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4)	Macherey-Nagel	740914.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker	incubated large capacity shaker	444-7084	Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	10010001
Plasmid mini-columns	Macherey-Nagel	740499.250	Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)	Macherey-Nagel	740911.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A	Macherey-Nagel	740505	Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid	Addgene	Plasmid #54642	Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato
TransIT-X2 Dynamic Delivery System	Mirus Bio	MIR 6000
Wash Buffer (AW)	Macherey-Nagel	740916.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer	Creality	CR10S	used to print the plate adapter
Blender Software	https://www.blender.org/ Free software under GNU General Public License (GPL).	version 2.79b	used to design the plate adapter