我们优化了一个方案,以分离和纯化鼠心脏围细胞,用于基础研究和研究其生物学和治疗潜力。
众所周知,微血管和毛细血管的血管内细胞在血管生成、血管稳定和内皮屏障完整性方面起着一定的作用。然而,他们在心脏的组织特定功能没有得到很好的理解。此外,目前尚无利用易于获取的材料来分离和纯化心脏源的围成体的协议。我们的协议侧重于使用广泛使用的哺乳动物模型,小鼠,作为我们的细胞来源。利用心脏组织的酶消化和机械解散,我们得到了一种粗细胞混合物,通过荧光激活细胞分拣(FACS)通过大量的标记进一步纯化。由于没有单一明确标记的围细胞,我们门控的细胞是CD31–CD34–CD45–CD140b+NG2+CD146+。纯化后,这些原细胞被培养和多次通过,在形态和标记表达上没有任何变化。利用我们的方案定期获得原生鼠心脏围细胞,我们希望进一步了解围细胞在心血管生理学中的作用及其治疗潜力。
被称为血管细胞的血管细胞环绕着血管1、2的微血管和毛细血管。在生理上,它们已知促进和发挥作用的血管生成,增加屏障完整性,由于其与内皮细胞的密切关系,以及稳定和成熟的血管1,2。此外,这些细胞的功能障碍和/或损失与阿尔茨海默氏病2、3和各种心血管疾病4等疾病有关。这些细胞在整个身体中都被发现,但细胞数量与组织相关。由于血脑屏障1、2的血管化程度高,在大脑中研究的围脑最为显著。然而,在心脏,围细胞的生物学研究不足。
最近,人们对于心脏围质器领域的兴趣增加,但目前尚无简化的协议,可以将其与生物学中最常用的工具之一——小鼠——隔离。文献中有关于从大脑5、视网膜6、胎盘7和骨骼肌8、9分离的食脑体的协议;然而,很少有协议是隔离围卵体从心脏。有几个组具有孤立的心脏围细胞。Nees等人能够从包括小鼠在内的多种物种中分离出大量心脏围细胞;然而,他们的方法使用特定的内部内置设备,降低了可重复性10。Avolio等人11、陈等人12人、贝利等人13日也成功从人的心脏组织中分离出心脏围细胞,但人体组织并非总能获得,一些研究者很难获得。在这里,我们开发了一种分离方法,从小鼠模型获得心脏围细胞,供研究人员用现成的材料进一步研究其生物学。
使用酶消化和荧光活化细胞分拣(FACS)与已知的关键围细胞标记14,我们的协议使我们能够分离和纯化以CD31–CD34–CD45为特征的围细胞群–CD140b=NG2+CD146=.我们的标记面板包含包含和排除标记。CD45用作标记,以排除造血细胞。CD31用作标记,以排除内皮细胞。CD34用作标记,以排除造血细胞和内皮祖细胞。CD146是血管周围细胞的标记物。最后,NG2和CD140b(也称为血小板衍生生长因子受体β+PDGFR®)都是围卵体14的公认标记。获得的主要区域性可以培养和多次传递,在形态或标记表达上没有变化。此外,这些细胞可以与内皮细胞共同培养,以研究它们之间的相互作用和串扰。这种细胞分离方法将使研究者能够从野生型、疾病和基因变异小鼠模型中研究心脏围细胞的生物学和病理生理学。
由于对心脏围质的研究相对较新,围细胞在心血管生理学和病理生理学中的作用尚未确定。在其他器官中,它们已被证明在血管平衡和灌注1,2中起着关键作用。与大脑等其他器官的围卵体文献相比,关于心脏围细胞的出版物明显减少。心脏围细胞的分离对于理解其功能特征和信号机制至关重要。因此,该协议将为研究者提供一种更容易的方式从更容易获得的组织来源访问心脏围细胞,并促进对其生物学的研究。它将有助于回答有关心脏围质如何促进心脏平衡和病理生理学的问题,以及研究其治疗潜力。
从鼠心中分离出来的围群,以CD31–CD34–CD45–CD140b + NG2+CD146+为特征,已经通过多次(最多到P12,并且仍然很强),这不生存能力下降并迅速传播(补充图2)。细胞也被冷冻和恢复,至少95%的生存能力。然而,我们更喜欢使用细胞P7或更年轻的实验。比较我们围细胞与人脑围细胞的明亮场图像,两个细胞系具有可比较的细胞形态(图4A),而它们与平滑肌细胞的形态不同(图4A)。我们的P7细胞的特点是免疫细胞化学的围细胞标记,一些从我们的FACS面板(NG2和CD140b),和几个不在面板(维明,德明,βSMA),我们发现细胞表达的围细胞标记同质(图4B)。此外,我们的P7细胞再次通过流细胞学分析,使用相同的标记面板,以评估由于传递引起的标记表达的变化,我们发现没有变化(图4C)。因此,无论是表型的,还是形态上的,我们的细胞都是围细胞。
Nees等人10、Avolio等人11、陈等人12人、贝利等人13人的研究表明,心脏围痕分离是成功的。然而,Nees等人10号使用内部定制设备将围网体从微容器中分离出来,涉及两个腔室,泵通过网状网堆来回注入蛋白酶溶液,这很难复制。未提供仪器的示意图和/或设备的图片及其构建方式。虽然Nees等人10成功地从许多物种中分离出心脏围细胞,但我们始终无法复制它们的方法。我们协议中的围杨分离步骤只是使用轨道振动器(分离所有细胞),在大多数(如果不是所有实验室)中,大多数实验室都可以使用,在锥形管中使用组织和酶溶液,然后是机械分离步骤。无需自定义设备。第二,其余的协议涉及人体组织的使用,因此,人体组织的采购仅限于研究者。我们的协议是修改和优化当前协议9,12使用小鼠模型(野生类型,转基因,疾病)和材料,随时可供所有研究者使用。
由于围脑细胞一般是敏感的,细胞的生存能力对于获得良好的产量至关重要。在心脏组织和细胞染色的采购过程中,组织/细胞需要保持冰冷。其次,组织的酶消化可能需要单独优化。根据酶小瓶的活动单位,浓度和消化时间可能需要优化。确保酶溶液每次都新鲜,否则产量会减少。第三,粗混合物含有大量的细胞,有些已经死亡和/或死亡,最好将染色缓冲液中的FBS浓度从5%降至2%。如果您在分类过程中遇到细胞堵塞喷嘴的问题,则首先使用死细胞去除试剂盒来丰富细胞。您还可以将 EDTA/HEPES 缓冲液或 DNase 治疗添加到细胞预排序中,以防止细胞聚集。最后,由于我们的抗体面板相当大,并且使用许多荧光团,请确保您的FMO控制和补偿控制正确完成。
这种方法的一个限制是每个心脏可以获得的心脏围细胞的数量。在我们的例子中,我们一个小鼠心脏的粗混合物中只有1.1%是围细胞,这和人类心脏分离的百分比相当,但由于小鼠提供的心脏组织量,细胞数量明显减少。由于 FACS 之后的细胞起始数量如此之低,因此最好同时从多个心脏分离。然而,问题在于你需要在一天内整理的细胞数量。如果你有超过3000万个细胞,将很难在不影响细胞生存能力的情况下通过排序。如果调查员有多个细胞分拣机,那么在一天内从多个心脏中分离是可以做到的。另一个限制是,因为我们不知道心脏中是否有围细胞的亚群,比如有骨骼肌15,16,我们不知道我们是否正在消除我们门控策略中的亚型。我们正在描述我们的心脏围形体,到目前为止,在我们的未发表的数据中,它们在功能上与文献中的其他围冰体一样。
我们的协议将使研究人员能够回答有关心脏坐周特性、特性、功能和其他方面的问题,这将有助于确定他们对心脏平衡和流体动力学的贡献。一旦这些细胞的生物学功能得到更好的理解,它们就可能对心血管疾病有治疗作用。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢 Amgen 流式细胞学核心在荧光素面板设计、故障排除和细胞分选方面的帮助。
0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-053-Cl | dilute with 1x DPBS to get 0.1% |
100 μM Cell strainer | FisherSci | 22363549 | |
15 mL Falcon conical tubes | BD | 352096 | |
24-well plate | Corning | CLS3527 | |
25 gauge butterfly needle | FisherSci | 22-253-146 | |
31 gauge needle syringe | FisherSci | B328446 | |
50 mL Falcon conical tubes | BD | 352098 | |
6-well plate | Corning | CLS3516 | |
anti-alpha smooth muscle actin rabbit mAb | abcam | ab32575 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-CD140b rabbit mAb | Cell Signaling | 28E1 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-CD31 rabbit pAb | abcam | ab28364 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-desmin rabbit pAb | abcam | ab8592 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-NG2 conjugated to AF488 | Millipore | MAB5384A4 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-vimentin rabbit mAb | abcam | ab92547 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
ArC Amine Reactive Compensation bead kit | Invitrogen | A10346 | compensation beads for Live/Dead Near IR dye |
Brightfield Microscope | camera attached | ||
CD140b-PE (clone APB5) | eBioscience | 12-1402-81 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
CD146-BV605 (clone ME-9F1) | BD | 740434 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
CD31-APC (clone MEC 13.3) | BD | 551262 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
CD34-BV421 (clone RAM 34) | BD | 56268 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11) | BD | 552848 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
Centrifuge | eppendorf | ||
Collagenase B | Roche | 11088815001 | 0.226 U/mg lyo. |
Confocal Microscope | |||
DAPI | ThermoFisher | D1306 | nuclear stain |
DMEM with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | 500 mL |
Dowell scissors | FST | 15040-11 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21-030-CV | 500 mL |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ca and Mg (CMF-DPBS) | Corning | 21-031-CV | 500 mL |
Dumont #5 Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
FACSAria cell sorter | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
FACSAria software | BD | ||
Falcon tube round-bottom polypropylene, 5 mL | BD | 38057 | |
Falcon tube with cell strainer cap, 5 mL | BD | 08-771-23 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015-CV | 500 mL |
Fine scissors | FST | 14060-09 | |
FlowJo software | FlowJo LLC | ||
Fortessa LSR flow cytometer | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
Gelatin-based coating | Cell Biologics | 6950 | |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Antibody used in ICC 1:1000 dilution |
Graefe Forceps | FST | 11049-10 | |
Heparin sodium solution | Hospira | NDC 0409-2720-02 | 10,000 USP units/10 mL; from porcine intestines |
Incubator | set at 37 °C, 5% CO2, 95% O2 | ||
Live/Dead-Near IR | Life Technologies | L10119 | |
Microscope slides | FisherSci | 12-550-343 | |
NG2-FITC | Millipore | AB5320A4 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
Oribital shaker | VWR | Inside 37 °C incubator or room | |
Paraformaldehyde | FisherSci | 50-980-487 | dilute with 1x DPBS to get 4% |
Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
Petri dish | FisherSci | FB0875714 | |
Pipette and tips | |||
ProLong Diamond | ThermoFisher | P36965 | mounting media |
Propidum Iodide | ThermoFisher | cell viability dye for supplemental figure 2 | |
Rabbit IgG FITC | eBiosciences | 11-4614-80 | Isotype control antibody – FITC |
Rat IgG2a APC | Biolegend | 400512 | Isotype control antibody – APC |
Rat IgG2a BV421 | Biolegend | 400536 | Isotype control antibody – BV421 |
Rat IgG2a BV605 | BD | 563144 | Isotype control antibody – BV605 |
Rat IgG2a PE | Biolegend | 400308 | Isotype control antibody – PE |
Rat IgG2b PE-Cy7 | Biolegend | 400617 | Isotype control antibody – PE-Cy7 |
SuperBlock | ThermoFisher | 37515 | blocking buffer |
T75 | ThermoFisher | 156499 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | detergent, dilute with x DPBS to get 0.1% |
UltraComp beads | Invitrogen | 01-2222-42 | compensation beads |
Variable-Flow Peristaltic Pump | FisherSci | 13-876-1 | |
ViCell Cell counter | Beckman | ||
Wash buffer | 1:10 dilution of Superblock in 1x DPBS |