Summary

Isolatie, cultuur, karakterisering, en differentiatie van menselijke spier voorlopercellen van de skeletspier biopsie procedure

Published: August 23, 2019
doi:

Summary

We presenteren technieken voor het isoleren, kweken, karakteriseren en differentiëren van menselijke primaire spier voorlopercellen (Hmpc’s) verkregen uit skeletspieren biopsie weefsel. hmpc’s verkregen en gekenmerkt door middel van deze methoden kunnen worden gebruikt om vervolgens onderzoek vragen met betrekking tot menselijke myogenese en skeletspier regeneratie aan te pakken.

Abstract

Het gebruik van primair menselijk weefsel en cellen is ideaal voor het onderzoeken van biologische en fysiologische processen zoals het regeneratief proces van skeletspieren. Er zijn erkende uitdagingen voor het werken met humane primaire adulte stamcellen, met name menselijke spier voorlopercellen (Hmpc’s) afgeleid van de skeletspieren biopsies, met inbegrip van lage celopbrengst van verzamelde weefsel en een grote mate van donor heterogeniteit van groei en dood parameters onder culturen. Hoewel het opnemen van heterogeniteit in een experimenteel ontwerp een grotere steekproefgrootte vereist om significante effecten te detecteren, kunnen we ook mechanismen identificeren die de variabiliteit in het uitbreidings vermogen van de hMPC ten grondslag liggen, waardoor we beter kunnen begrijpen heterogeniteit in skeletspieren regeneratie. Nieuwe mechanismen die het uitbreidings vermogen van culturen onderscheiden hebben het potentieel om te leiden tot de ontwikkeling van therapieën om de regeneratie van de skeletspieren te verbeteren.

Introduction

Skeletspieren is het grootste orgaansysteem in het menselijk lichaam, dat 30 − 40% van het hele lichaam massa1. Naast zijn goed erkende rol in motoriek, skeletspieren handhaaft lichaamstemperatuur en houding, en speelt een centrale rol in het hele lichaam nutriënt homeostase. Onderzoek waarbij menselijke deelnemers, dieren en celkweek modellen betrokken zijn, zijn allemaal waardevol om vragen te beantwoorden die betrekking hebben op de biologie en regeneratie van skeletspieren. Isolatie en cultuur van menselijke primaire spier voorlopercellen (Hmpc’s) biedt een robuust model waarmee celkweek technieken en manipulaties kunnen worden toegepast op menselijke monsters. Een voordeel van het gebruik van hmpc’s is dat zij het genetische en metabole fenotype van elke donor2,3behouden. Door het onderhoud van het fenotype van de donor kunnen onderzoekers de Inter-individuele variatie in het myogene proces onderzoeken. We hebben bijvoorbeeld onze hMPC-karakterisatie methode gebruikt om leeftijds-en geslachts verschillen in de hMPC-uitbreidingscapaciteit4te identificeren.

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde technieken te isoleren, cultuur, karakteriseren, en differentiëren hMPCs van skeletspieren biopsie weefsel. Voortbouwend op eerder werk dat hmpc’s beschreef en potentiële celoppervlakte makers voor hmpc Isolation5,6identificeerde, vult dit protocol een kritieke kloof in kennis door de isolatie te koppelen aan de karakterisering van hmpcs. Verder maken de gedetailleerde stapsgewijze instructies in dit protocol hMPC-isolatie en karakterisering toegankelijk voor een breed wetenschappelijk publiek, inclusief mensen met beperkte voorafgaande ervaring met hMPCs. Ons protocol is een van de eersten die het gebruik van een beeldvormings cytometer beschrijven om celpopulaties te volgen. Nieuw ontworpen beeldvormings Cytometers zijn State-of-the-Art, high-throughput en Microplate-gebaseerd, waardoor Live-celbeeldvorming, celtellingen en meerkanaals fluorescentie analyse van alle cellen in elke put van een kweek vaartuig binnen enkele minuten mogelijk is. Dit systeem zorgt voor een snelle kwantificering van dynamische veranderingen in de proliferatie en levensvatbaarheid van een volledige celpopulatie, met slechts minimale verstoring van de cultuur. Zo kunnen we op opeenvolgende dagen in vitro objectieve maatregelen van samenvloeiing uitvoeren om de groei kinetiek van elke uit verschillende donoren afkomstige cultuur te bepalen. Veel protocollen in de literatuur, met name die met betrekking tot de differentiatie van de Mpc’s, vereisen dat cellen een bepaald niveau van samenvloeiing bereiken voordat differentiatie of behandeling7wordt gestart. Onze methode zorgt voor een objectieve bepaling van de samenvloeiing van elke put in een kweek vaartuig, waardoor onderzoekers de behandeling op een onbevooroordeelde, niet-subjectieve manier kunnen initiëren.

In het verleden was een grote beperking van het gebruik van primaire Hmpc’s lage opbrengsten die het aantal beschikbare cellen voor experimenten beperken. Wij en anderen hebben aangetoond dat de opbrengst van de Mpc’s van skeletspieren biopsie weefsel is 1 − 15 MPCs per milligram weefsel (Figuur 1)8. Omdat ons protocol vier passages van de cellen toestaat voorafgaand aan zuivering met fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), zijn onze cryopreserved hMPC-opbrengsten, afgeleid van kleine hoeveelheden biopsie weefsel (50 − 100 mg), voldoende om onderzoeksdoelen te adressen waar Er zijn meerdere experimenten vereist. Ons FACS-protocol produceert een ~ 80% pure (Pax7 positive) MPC populatie, dus ons protocol is geoptimaliseerd voor zowel opbrengst als zuiverheid.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de institutioneel beoordelings Raad van de Cornell-universiteit. Alle deelnemers werden gescreend op onderliggende gezondheidsomstandigheden en gaven geïnformeerde toestemming. 1. het verkrijgen van menselijk spierweefsel via de skeletspieren biopsie Identificeer de spier van de quadriceps lateralis via palpatie, anatomische monumenten en actieve contractie van de spier. Palpate de quadriceps lateralis door de deelnemer hun quadriceps spier…

Representative Results

Representatieve Flowcytometrie resultaten van hMPC-isolatie van menselijk spierweefsel kunnen worden bekeken in Figuur 1. Hmpc’s kunnen worden geïdentificeerd door eerste gating gebeurtenissen op basis van Side Scatter en forward Scatter om dode cellen of puin te elimineren, gevolgd door het selecteren van alleen cellen die negatief zijn voor 7-AAD en daarom levensvatbaar zijn. Selectie van cellen positief voor zowel de cel oppervlak markeringen CD56 en CD29…

Discussion

Primaire Hmpc’s zijn een belangrijk onderzoeksmodel dat wordt gebruikt om de skeletspieren biologie en het regeneratieve proces te begrijpen. Daarnaast hebben Hmpc’s het potentieel om te worden gebruikt voor therapie. Echter, er zijn erkende uitdagingen in het gebruik van primaire Hmpc’s voor zowel onderzoek en therapie, met inbegrip van de beperkte kennis van cellen die zijn afgeleid van mensen10. Er is ook een grote mate van variatie in de uitbreidingscapaciteit tussen donor culturen, die het po…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken de Cornell University, biotechnologie Resource Center Imaging Facility voor hun hulp met fluorescentie geactiveerde celsortering. We danken Molly Gheller ook voor haar hulp bij de werving van deelnemers en Erica Bender voor het uitvoeren van de skeletspieren biopsies. Tot slot danken wij de deelnemers voor hun tijd en deelname aan de studie. Dit werk werd gesteund door het Nationaal Instituut voor de veroudering van de National Institutes of Health onder het Awardnummer R01AG058630 (to B.D.C. and A.E.T.), door een Glenn Foundation for Medical Research en American Federation for Aging Research Grant voor Junior Faculty (naar B . D.C.), en door de Voorzitter van de Raad voor Cornell-vrouwen (A.E.T.).

Materials

0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-Cl Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate VWR 664160 Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube Falcon 352196 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate Grenier Bio-One 662 160 Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution eBioscience 00-6993-50 Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 BioLegend 303016 Conjugated antibody for FACS 
Black 96-well cell culture plate Grenier Bio-One 655079 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S Nexcelcom Bioscience Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer VWR 352350 Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail) Corning 354236 Collagen for coating cell culture plates 
Collagenase D Roche 11 088 882 001 Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide VWR WN182 Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II Sigma Life Sciences D4693 A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder Gibco 31600-034 Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 21600-010 PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate J.T. Baker 4040-01  Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum VWR 89510-186  Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12 Gibco 21700-026 Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum Gibco 26-050-070 Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer iNCyto DHC-N0105 Used to count cells
Hibernate A Gibco A1247501 Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate Life Technologies H21492 DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol Fisher Scientific A416P-4 Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer Orflo MXA006 Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes Orflo MXC002 Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter Orflo Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%) Thermo Fisher Scientific 50062Z Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 BD Pharmingen 557747 Conjugated antibody for FACS 
Penicillin/Streptomycin 100X Solution Corning 30-002-CI Antibiotics added to culture media
Propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566 DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor Promega G5071 Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium  Gibco 12648-010 Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-3 Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes VWR 60818-565 Tubes used for FACS
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42 Compensation beads fort calibrating flow FACS settings

References

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. D’Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
  3. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
  4. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
  5. Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
  6. Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
  7. Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
  8. Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
  9. Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Cryopreservation and thawing of cells. Current Protocols in Immunology. , (2012).
  10. Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy – from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).
  11. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
  12. Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).
check_url/kr/59580?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Gheller, B. J., Blum, J., Soueid-Baumgarten, S., Bender, E., Cosgrove, B. D., Thalacker-Mercer, A. Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure. J. Vis. Exp. (150), e59580, doi:10.3791/59580 (2019).

View Video