Summary

Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren

Published: August 23, 2019
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Summary

Wir präsentieren Techniken zur Isolierung, Kultivierung, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsiegewebe gewonnen werden. hMPCs, die durch diese Methoden gewonnen und charakterisiert werden, können anschließend verwendet werden, um Forschungsfragen im Zusammenhang mit menschlicher Myogenese und Skelettmuskelregeneration zu behandeln.

Abstract

Die Verwendung von primärem menschlichem Gewebe und Zellen ist ideal für die Untersuchung biologischer und physiologischer Prozesse wie der Regenerationsprozess des Skelettmuskels. Es gibt anerkannte Herausforderungen bei der Arbeit mit menschlichen primären adulten Stammzellen, insbesondere menschlichen Muskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsien abgeleitet sind, einschließlich geringer Zellausbeute aus gesammeltem Gewebe und einem hohen Grad an Spenderheterogenität Wachstums- und Todesparameter zwischen den Kulturen. Während die Integration von Heterogenität in experimentelles Design eine größere Stichprobengröße erfordert, um signifikante Effekte zu erkennen, ermöglicht es uns auch, Mechanismen zu identifizieren, die der Variabilität der hMPC-Erweiterungskapazität zugrunde liegen, und ermöglicht es uns, die Sbeinen-Erweiterungskapazität besser zu verstehen. Heterogenität in der Skelettmuskelregeneration. Neuartige Mechanismen, die die Expansionsfähigkeit von Kulturen unterscheiden, haben das Potenzial, zur Entwicklung von Therapien zur Verbesserung der Regeneration der Skelettmuskulatur zu führen.

Introduction

Skelettmuskel ist das größte Organsystem im menschlichen Körper, macht 30 bis 40% der ganzen Körpermasse1. Neben seiner anerkannten Rolle in der Fortbewegung, Skelettmuskel hält Körpertemperatur und Körperhaltung, und spielt eine zentrale Rolle in ganzkörperlichen Nährstoff Homöostase. Die Forschung unter Beteiligung menschlicher Teilnehmer, Tiere und Zellkulturmodelle ist wertvoll, um Fragen der Skelettmuskelbiologie und Regeneration zu beantworten. Isolation und Kultur der menschlichen Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs) bietet ein robustes Modell, das es ermöglicht, Zellkulturtechniken und Manipulationen auf menschliche Proben anzuwenden. Ein Vorteil der Verwendung von hMPCs ist, dass sie den genetischen und metabolischen Phänotyp von jedem Spender behalten2,3. Die Aufrechterhaltung des Spenderphänotyps ermöglicht es forschern, interindividuelle Variationen im myogenen Prozess zu untersuchen. Zum Beispiel haben wir unsere hMPC-Charakterisierungsmethode eingesetzt, um alters- und geschlechtsbedingte Unterschiede in der hMPC-Populationsexpansionskapazität4zu identifizieren.

Der Zweck dieses Protokolls ist es, Techniken zur Isolierung, Kultur, Charakterisierung und Unterscheidung von hMPCs aus Skelettmuskelbiopsiegewebe zu beschreiben. Aufbauend auf früheren Arbeiten, die hMPCs beschrieben und potenzielle Zelloberflächenhersteller für die hMPC-Isolierung5,6identifiziert haben, schließt dieses Protokoll eine kritische Wissenslücke, indem es die Isolation mit der Charakterisierung von hMPCs verknüpft. Darüber hinaus machen die detaillierten Schritt-für-Schritt-Anleitungen in diesem Protokoll die hMPC-Isolierung und -Charakterisierung einem breiten wissenschaftlichen Publikum zugänglich, einschließlich derjenigen mit begrenzter Vorerfahrung mit hMPCs. Unser Protokoll gehört zu den ersten, die die Verwendung eines bildgebenden Zytometers zur Verfolgung von Zellpopulationen beschreiben. Neu entwickelte bildgebende Zytometer sind modernste, hochdurchsatz- und mikroplattenbasierte, die live zellbildende, Zellzählung und Mehrkanalfluoreszenzanalyse aller Zellen in jedem Brunnen eines Kulturgefäßes innerhalb von Minuten ermöglichen. Dieses System ermöglicht eine schnelle Quantifizierung dynamischer Veränderungen der Proliferation und Lebensfähigkeit einer gesamten Zellpopulation mit nur minimalen Unterbrechungen der Kultur. Beispielsweise sind wir in der Lage, objektive Maßnahmen des Zusammenflusses an aufeinanderfolgenden Tagen in vitro durchzuführen, um die Wachstumskinetik jeder Kultur zu bestimmen, die von verschiedenen Spendern abgeleitet wurde. Viele Protokolle in der Literatur, insbesondere solche, die die Differenzierung von MFC beinhalten, erfordern, dass Zellen ein definiertes Maß an Zusammenfluss erreichen, bevor sie Differenzierung oder Behandlung einführen7. Unsere Methode ermöglicht eine objektive Bestimmung des Zusammenflusses jedes Brunnens in einem Kulturgefäß, so dass Forscher eine unvoreingenommene, nicht-subjektive Behandlung initiieren können.

In der Vergangenheit war eine wesentliche Einschränkung der Verwendung von primären hMPCs niedrige Erträge, die die Anzahl der Zellen begrenzen, die für Experimente verfügbar sind. Wir und andere haben gezeigt, dass die Ausbeute von MPCs aus Skelettmuskelbiopsiegewebe 1-15 MPCs pro Milligramm Gewebe beträgt (Abbildung 1)8. Da unser Protokoll vier Passagen der Zellen vor der Reinigung mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zulässt, reichen unsere kryokonservierten hMPC-Erträge, die aus kleinen Mengen Biopsiegewebe (50 bis 100 mg) gewonnen werden, aus, um Forschungsziele zu erreichen, mehrere Experimente sind erforderlich. Unser FACS-Protokoll erzeugt eine reine (Pax7-positive) MPC-Population von 80 %, daher ist unser Protokoll sowohl für die Ausbeute als auch für die Reinheit optimiert.

Protocol

Dieses Protokoll wurde vom Institutional Review Board der Cornell University genehmigt. Alle Teilnehmer wurden auf die zugrunde liegenden gesundheitlichen Bedingungen untersucht und gaben ihre Einwilligung in Kenntnis der Sachlage ab. 1. Beschaffung von menschlichem Muskelgewebe über die Skelettmuskelbiopsie Identifizieren Sie den Vastus lateralis Muskel durch Palpation, anatomische Landmarken und aktive Kontraktion des Muskels. Palpate die vastus lateralis, indem der Teil…

Representative Results

Repräsentative Durchflusszytometrie Ergebnisse der hMPC-Isolierung aus menschlichem Muskelgewebe können in Abbildung 1dargestellt werden. hMPCs können durch erste Gating-Ereignisse identifiziert werden, die auf Seitenstreuung und Vorwärtsstreuung basieren, um abgestorbene Zellen oder Trümmer zu beseitigen, gefolgt von der Auswahl nur von Zellen, die für 7-AAD negativ sind und daher lebensfähig sind. Die Auswahl der Zellen, die sowohl für die Zelloberf…

Discussion

Primäre hMPCs sind ein wichtiges Forschungsmodell, das verwendet wird, um skelettierte Muskelbiologie und den regenerativen Prozess zu verstehen. Darüber hinaus haben hMPCs das Potenzial, für die Therapie verwendet zu werden. Es gibt jedoch anerkannte Herausforderungen bei der Verwendung von primären hMPCs für Forschung und Therapie, einschließlich des begrenzten Verständnisses von Zellen, die vom Menschen abgeleitet sind10. Es gibt auch eine große Variation in der Expansionskapazität zwi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken der Cornell University, Biotechnology Resource Center Imaging Facility für ihre Hilfe bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung. Wir danken auch Molly Gheller für ihre Hilfe bei der Rekrutierung von Teilnehmern und Erica Bender für die Durchführung der Skelettmuskelbiopsien. Abschließend danken wir den Teilnehmern für ihre Zeit und ihre Teilnahme an der Studie. Diese Arbeit wurde vom National Institute on Aging of the National Institutes of Health unter der Award-Nummer R01AG058630 (nach B.D.C. und A.E.T.), von einer Glenn Foundation for Medical Research und der American Federation for Aging Research Grant for Junior Faculty (zu B) unterstützt. . D.C.) und vom President es Council for Cornell Women (bis A.E.T.).

Materials

0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-Cl Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate VWR 664160 Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube Falcon 352196 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate Grenier Bio-One 662 160 Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution eBioscience 00-6993-50 Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 BioLegend 303016 Conjugated antibody for FACS 
Black 96-well cell culture plate Grenier Bio-One 655079 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S Nexcelcom Bioscience Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer VWR 352350 Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail) Corning 354236 Collagen for coating cell culture plates 
Collagenase D Roche 11 088 882 001 Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide VWR WN182 Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II Sigma Life Sciences D4693 A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder Gibco 31600-034 Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 21600-010 PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate J.T. Baker 4040-01  Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum VWR 89510-186  Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12 Gibco 21700-026 Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum Gibco 26-050-070 Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer iNCyto DHC-N0105 Used to count cells
Hibernate A Gibco A1247501 Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate Life Technologies H21492 DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol Fisher Scientific A416P-4 Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer Orflo MXA006 Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes Orflo MXC002 Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter Orflo Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%) Thermo Fisher Scientific 50062Z Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 BD Pharmingen 557747 Conjugated antibody for FACS 
Penicillin/Streptomycin 100X Solution Corning 30-002-CI Antibiotics added to culture media
Propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566 DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor Promega G5071 Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium  Gibco 12648-010 Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-3 Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes VWR 60818-565 Tubes used for FACS
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42 Compensation beads fort calibrating flow FACS settings

References

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Cite This Article
Gheller, B. J., Blum, J., Soueid-Baumgarten, S., Bender, E., Cosgrove, B. D., Thalacker-Mercer, A. Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure. J. Vis. Exp. (150), e59580, doi:10.3791/59580 (2019).

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