בידוד, תרבות, אפיון, והבידול של תאים האדם שריר ביופסיה של השלד שרירי השגרה נוהל
Summary
אנו מציגים טכניקות עבור בידוד, culturing, אפיון, וההבחנה תאים האדם העיקרי שריר השריר (hMPCs) המתקבל רקמת שריר השלד ביופסיה. hmpcs התקבל ומאופיין באמצעות שיטות אלה ניתן להשתמש לאחר מכן לכתובת מחקר שאלות הקשורות מיוגנזה האדם התחדשות השלד שריר.
Abstract
השימוש ברקמות ובתאים האנושיים העיקריים הוא אידיאלי לחקירת תהליכים ביולוגיים ופיזיולוגיים כגון תהליך ההתחדשות של שריר השלד. ישנם אתגרים מזוהים לעבוד עם בתאי גזע האדם העיקרי בוגרים, במיוחד בתאי שריר האדם בתאים (hMPCs) נגזר ביופסיות שריר השלד, כולל התשואה התא נמוך מרקמות שנאספו ומידה גדולה של התורם טרוגניות של מערכי צמיחה ומוות בקרב תרבויות. בעוד שילוב טרוגניות לתוך העיצוב הניסיוני דורש גודל מדגם גדול יותר כדי לזהות אפקטים משמעותיים, זה גם מאפשר לנו לזהות מנגנונים כי השונות ושתתות קיבולת הרחבת hmpc, ובכך מאפשר לנו להבין טוב יותר טרוגניות שרירים התחדשות השלד. מנגנונים חדשניים המבדילים את יכולת ההתרחבות של תרבויות יש את הפוטנציאל להוביל לפיתוח של טיפולים כדי לשפר את התחדשות שריר השלד.
Introduction
שריר השלד הוא מערכת האיברים הגדולה ביותר בגוף האדם, חשבונאות עבור 30-40% של מסת הגוף כולו1. בנוסף התפקיד שלה מזוהה היטב תנועה, שריר השלד שומרת על טמפרטורת הגוף ויציבה, וממלא תפקיד מרכזי הומאוסטזיס מזינים הגוף כולו. מחקרים הקשורים למשתתפים אנושיים, בעלי חיים ומודלים של תרבות התא הם כולם יקרי ערך לטפל בשאלות הנוגעות לביולוגיה שריר השלד והתחדשות. בידוד ותרבות של תאים אנושיים שרירים ראשוניים (hMPCs) מספק מודל חזק המאפשר לטכניקות תרבות התא ומניפולציות להיות מיושם על דגימות אנושיות. היתרון של שימוש hmpcs הוא שהם שומרים את מושגים גנטיים ומטבולית מכל תורם2,3. תחזוקת פנוטיפ התורם מאפשרת לחוקרים לבחון וריאציה בין-אישית בתהליך היוגניים. לדוגמה, העסקנו את שיטת האפיון hMPC שלנו כדי לזהות הבדלים בין הגילאים והמין בקיבולת הרחבת אוכלוסיית hMPC4.
מטרת פרוטוקול זה היא לפרט טכניקות כדי לבודד, תרבות, לאפיין, ולהבדיל hMPCs מרקמת ביופסיה שריר השלד. בניין על עבודה קודמת שתיאר hmpcs וזיהה מקבלי הפנים הפוטנציאליים תאים עבור בידוד hmpcs5,6, פרוטוקול זה ממלא פער קריטי בידע על ידי קישור בידוד לאפיון של hmpcs. עוד, הוראות צעד אחר צעד המפורטים בפרוטוקול זה להפוך את הבידוד hMPC ואפיון נגיש לקהל מדעי רחב, כולל אלה עם ניסיון קודם מוגבל עם Hmpc. הפרוטוקול שלנו הוא בין הראשונים לתאר שימוש בציטוטומטר הדמיה כדי לעקוב אחר אוכלוסיות תאים. ציטוטומטרים מעוצבים לאחרונה הם מדינה-של-האמנות, תפוקה גבוהה ומיקרופלייט, המאפשרת הדמיה של תא חי, ספירת תאים וניתוח של קרינה פלואורסצנטית רב-ערוצית של כל התאים בכל באר של כלי תרבות בתוך דקות. מערכת זו מאפשרת כימות מהירה של שינויים דינמיים בהתפשטות ובכדאיות של אוכלוסיית תאים שלמה עם הפרעה מינימלית בלבד לתרבות. לדוגמה, אנו מסוגלים לבצע פעולות אובייקטיביות של המפגש בימים רצופים בחוץ כדי לקבוע את קינטיקה הגדילה של כל תרבות הנגזרת מתורמים שונים. פרוטוקולים רבים בספרות, במיוחד אלה הקשורים הבידול של MPCs, דורשים תאים כדי להגיע לרמה מוגדרת של המפגש לפני התחלת בידול או טיפול7. השיטה שלנו מאפשרת קביעה אובייקטיבית של הזרימה של כל באר בכלי תרבות המאפשר לחוקרים ליזום טיפול באופן לא משוחד ולא סובייקטיבי.
בעבר, מגבלה עיקרית של שימוש hMPCs הראשי היה תשואה נמוכה המגבילות את מספר התאים הזמינים עבור ניסויים. אנחנו ואחרים הראו את התשואה של MPCs מן רקמת ביופסיה שריר השלד הוא 1-15 MPCs לכל מיליגרם של רקמה (איור 1)8. בגלל הפרוטוקול שלנו מאפשר ארבעה קטעים של התאים לפני טיהור עם מיון התא המופעל על ידי הזריחה (FACS), שלנו היבול hMPC שלנו, נגזר כמויות קטנות של רקמת ביופסיה (50-100 מ ג), הם מספיק כדי לטפל במטרות מחקר שבו יש צורך בניסויים מרובים. פרוטוקול ה-FACS שלנו מפיק אוכלוסיית MPC טהורה של ~ 80% (Pax7 חיוביים), ולכן הפרוטוקול שלנו ממוטב לתשואה ולטוהר.
Protocol
Representative Results
Discussion
הראשי hMPCs הם מודל מחקר חשוב המשמש להבנת ביולוגיה שריר השלד ואת תהליך ההתחדשות. בנוסף, hMPCs יש את הפוטנציאל לשמש טיפול. עם זאת, ישנם אתגרים מזוהים באמצעות hMPCs הראשי עבור מחקר וטיפול, כולל הבנה מוגבלת של תאים הנגזרים מבני אדם10. יש גם מידה גדולה של וריאציה בקיבולת הרחבה בין תרבויות ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לאוניברסיטת קורנל, ביוטכנולוגיה מרכז משאבים הדמיה עבור עזרתם עם מיון תא המופעל הקרינה. אנו מודים גם מולי Gheller על עזרתה עם גיוס משתתף ואריקה בנדר על ניהול ביופסיות שריר השלד. לבסוף, אנו מודים למשתתפים על זמנם והשתתפותו במחקר. עבודה זו היתה נתמכת על ידי המכון הלאומי על הזדקנות המוסדות הלאומיים לבריאות תחת הפרס מספר R01AG058630 (כדי B.D.C. ו A.E.T.), על ידי קרן גלן למחקר רפואי הפדרציה האמריקנית למענק מחקר הזדקנות עבור הפקולטה זוטר (ב . Dc), ועל ידי מועצת הנשיא לנשות קורנל (לA.E.T.).
Materials
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
| 10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
| 24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
| Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
| Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
| Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
| Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
| Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
| Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
| Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
| Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
| Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
| Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
| PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100X Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
| Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
| Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- D’Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
- Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
- Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
- Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
- Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
- Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Cryopreservation and thawing of cells. Current Protocols in Immunology. , (2012).
- Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy – from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
- Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).
