Isolasjon, kultur, karakterisering, og differensiering av Human Muscle stamceller fra skjelettmuskelen biopsi prosedyre

Summary

Vi presenterer teknikker for å isolere, dyrking, karakteriserer, og differensiere menneskelige primære muskel stamceller (hMPCs) innhentet fra skjelettlidelser muskel biopsi vev. hMPCs innhentet og preget gjennom disse metodene kan brukes til senere adresse forskning spørsmål knyttet til menneskelig myogenesis og skjelettlidelser muskel gjenfødelse.

Abstract

Bruken av primære menneskelige vev og celler er ideell for etterforskning av biologiske og fysiologiske prosesser som skjelettlidelser muskel regenererende prosessen. Det er anerkjente utfordringer for å arbeide med menneskelige primære voksne stamceller, spesielt menneskelige muskel stamceller (hMPCs) avledet fra skjelettlidelser muskel biopsier, inkludert lav celle utbytte fra samlet vev og en stor grad av giver heterogenitet av vekst og død parametre blant kulturer. Mens innlemme heterogenitet i eksperimentell design krever en større utvalgsstørrelse for å oppdage betydelige effekter, det gjør det også mulig for oss å identifisere mekanismer som ligger til grunn variasjon i hMPC ekspansjons kapasitet, og dermed gir oss mulighet til å bedre forstå heterogenitet i skjelettlidelser muskel gjenfødelse. Novel mekanismer som skiller ekspansjons kapasitet av kulturer har potensial til å føre til utvikling av terapier for å forbedre skjelettlidelser muskel gjenfødelse.

Introduction

Skjelettmuskel er den største organ system i menneskekroppen, sto for 30 − 40% av hele kroppen masse¹. I tillegg til sin godt anerkjente rolle i bevegelse, opprettholder Skjelettmuskel kroppstemperatur og holdning, og spiller en sentral rolle i hele kroppen næringsstoffer homeostase. Forskning som involverer menneskelige deltakere, dyr, og cellekultur modeller er alle verdifulle for å ta opp spørsmål knyttet til skjelettlidelser muskel biologi og regenerering. Isolering og kultur av menneskets primære muskel stamceller (hMPCs) gir en robust modell som gjør det mulig for cellekultur teknikker og manipulasjoner som skal brukes til menneskelige prøver. En fordel med å bruke hMPCs er at de beholder den genetiske og metabolske fenotype fra hver giver^2,3. Vedlikehold av giver fenotype gjør det mulig for forskere å undersøke forskjellene mellom individuelle variasjoner i myogenic prosessen. For eksempel har vi ansatt vår hMPC karakterisering metode for å identifisere alder-og sex-relaterte forskjeller i hMPC befolknings ekspansjon kapasitet⁴.

Formålet med denne protokollen er å detalj teknikker for å isolere, kultur, karakterisere, og differensiere hMPCs fra skjelettlidelser muskel biopsi vev. Bygger på tidligere arbeid som beskrev hMPCs og identifiserte potensielle celle overflate beslutningstakere for hMPC isolasjon^5,6, denne protokollen fyller en kritisk gap i kunnskap ved å knytte isolasjonen til karakterisering av hMPCs. Videre detaljerte trinn-for-trinn-instruksjoner inkludert i denne protokollen gjør hMPC isolasjon og karakterisering tilgjengelig for et bredt vitenskapelig publikum, inkludert de med begrenset tidligere erfaring med hMPCs. Vår protokoll er blant de første til å beskrive bruken av en tenkelig flowcytometer å spore celle populasjoner. Nydesignede Imaging cytometers er State-of-the-art, høy gjennomstrømming, og mikroplate-basert, slik at Live celle Imaging, celle telling, og flerkanals fluorescens analyse av alle celler i hver brønn av et kultur fartøy i løpet av minutter. Dette systemet gjør det mulig for rask kvantifisering av dynamiske endringer i spredning og levedyktighet av en hel celle befolkning med bare minimale avbrudd i kulturen. For eksempel, vi er i stand til å utføre objektive tiltak av samløpet på etterfølgende dager in vitro å bestemme vekst Kinetics av hver kultur avledet fra ulike givere. Mange protokoller i litteraturen, spesielt de som involverer differensiering av MPCs, krever celler for å nå et definert nivå av samløpet før initiering differensiering eller behandling⁷. Vår metode gir mulighet for objektiv bestemmelse av samløpet av hver brønn i et kultur fartøy som tillater forskere å initiere behandling i en upartisk, ikke-subjektiv måte.

I det siste, en stor begrensning av å bruke primære hMPCs var lav avkastning som begrenser antall celler tilgjengelig for eksperimenter. Vi og andre har vist utbyttet av MPCs fra skjelettlidelser muskel biopsi vev er 1 − 15 MPCs per milligram av vev (figur 1)⁸. Fordi vår protokoll tillater fire passasjer av cellene før rensing med fluorescens aktivert celle sortering (FACS), vår embryo hMPC gir, avledet fra små mengder av biopsi vev (50 − 100 mg), er tilstrekkelig til å ta opp forsknings mål der Det kreves flere eksperimenter. Vår FACS-protokoll produserer en ~ 80% ren (Pax7 positiv) MPC-befolkning, og derfor er vår protokoll optimalisert for både avkastning og renhet.

Protocol

Denne protokollen ble godkjent av den institusjonelle Review styret ved Cornell University. Alle deltakerne ble vist for underliggende helsemessige forhold og ga informert samtykke. 1. innhenting menneskelig muskel vev via skjelettmuskelen biopsi Identifiser Vastus lateralis muskelen via palpasjon, anatomiske landemerker, og aktiv sammentrekning av muskelen. Palpate den Vastus lateralis ved å ha deltakeren stramme sine quadriceps muskler og finne magen av muskelen, ca 1/3 …

Representative Results

Representative Flow flowcytometri resultatene av hMPC isolering fra humant muskel vev kan sees i figur 1. hMPCs kan identifiseres ved første gating hendelser basert på side scatter og videresende scatter for å eliminere døde celler eller rusk, etterfulgt av å velge bare celler som er negative for 7-AAD og derfor er levedyktig. Valg av celler positive for både celleoverflaten markører CD56 og CD29 representerer hMPC befolkningen. En biopsi på 60 mg gir…

Discussion

Primær hMPCs er en viktig forsknings modell som brukes til å forstå Skjelettmuskel biologi og regenererende prosessen. I tillegg har hMPCs potensial til å bli brukt til terapi. Imidlertid, der er annerkjent angripe inne benytter primære hMPCs for begge to forskning og terapi, inkluderer det begrenset forståelse av celler avledet fra Human¹⁰. Det er også en stor grad av variasjon i Utvidelses kapasiteten blant donor kulturer, som begrenser potensialet for bruk av hMPCs og kan påvirke forskn…

Materials

0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate	VWR	664160	Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube	Falcon	352196	15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate	Grenier Bio-One	662 160	Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution	eBioscience	00-6993-50	Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16	BioLegend	303016	Conjugated antibody for FACS
Black 96-well cell culture plate	Grenier Bio-One	655079	96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S	Nexcelcom Bioscience		Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer	VWR	352350	Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail)	Corning	354236	Collagen for coating cell culture plates
Collagenase D	Roche	11 088 882 001	Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide	VWR	WN182	Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder	Gibco	31600-034	Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate	J.T. Baker	4040-01	Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum	VWR	89510-186	Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12	Gibco	21700-026	Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum	Gibco	26-050-070	Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer	iNCyto	DHC-N0105	Used to count cells
Hibernate A	Gibco	A1247501	Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Life Technologies	H21492	DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer	Orflo	MXA006	Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes	Orflo	MXC002	Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter	Orflo		Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159	BD Pharmingen	557747	Conjugated antibody for FACS
Penicillin/Streptomycin 100X Solution	Corning	30-002-CI	Antibiotics added to culture media
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor	Promega	G5071	Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Gibco	12648-010	Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3	Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes	VWR	60818-565	Tubes used for FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Compensation beads fort calibrating flow FACS settings