Vi presenterar tekniker för att isolera, odla, karakterisera och differentiera mänskliga primära muskelstamceller (hMPCs) som erhållits från skelettmuskel biopsi vävnad. hmpcs erhålls och kännetecknas genom dessa metoder kan användas för att därefter behandla forskningsfrågor relaterade till mänsklig myogenes och skelettmuskulaturen förnyelse.
Användningen av primär mänsklig vävnad och celler är idealisk för utredning av biologiska och fysiologiska processer såsom skelettmuskulaturen regenerativ process. Det finns erkända utmaningar att arbeta med mänskliga primära vuxna stamceller, särskilt humana muskelstamceller (hMPCs) härrör från skelettmuskel biopsier, inklusive låg cell avkastning från insamlade vävnad och en stor grad av givarens heterogenitet av tillväxt och död parametrar bland kulturer. Samtidigt införliva heterogenitet i experimentell design kräver en större urvalsstorlek för att upptäcka betydande effekter, det gör det också möjligt för oss att identifiera mekanismer som ligger bakom variationer i hMPC expansions kapacitet, och därmed ger oss möjlighet att bättre förstå heterogenitet i skelettmuskulaturen förnyelse. Nya mekanismer som skiljer kulturernas expansions förmåga har potential att leda till utveckling av terapier för att förbättra skelettmuskel förnyelse.
Skelettmuskulaturen är det största organsystemet i människokroppen, står för 30 − 40% av hela kroppen massa1. Förutom sin väl erkända roll i Locomotion, skelettmuskulaturen upprätthåller kroppstemperatur och hållning, och spelar en central roll i hela kroppen näringsämnen homeostas. Forskning som involverar mänskliga deltagare, djur och modeller cellkulturer är alla värdefulla för att ta itu med frågor som rör skelettmuskulaturen biologi och förnyelse. Isolering och kultur av mänskliga primära muskelstamceller (hMPCs) ger en robust modell som gör det möjligt för cellkulturer tekniker och manipulationer som skall tillämpas på mänskliga prover. Fördelen med att använda hmpcs är att de behåller den genetiska och metaboliska fenotypen från varje donator2,3. Underhåll av donatorns fenotyp gör det möjligt för forskarna att undersöka inter-individuell variation i den myogena processen. Till exempel har vi använt vår hMPC karakterisering metod för att identifiera ålder och kön-relaterade skillnader i hMPC populations expansion kapacitet4.
Syftet med detta protokoll är att detalj tekniker för att isolera, kultur, karakterisera, och differentiera hMPCs från skelettmuskel biopsi vävnad. Bygger på tidigare arbete som beskrivs hmpcs och identifierade potentiella cell ytan beslutsfattare för HMPC isolering5,6, detta protokoll fyller ett kritiskt gap i kunskap genom att koppla isoleringen till karakterisering av hmpcs. Vidare, detaljerade steg-för-steg-instruktioner som ingår i detta protokoll gör hMPC isolering och karakterisering tillgänglig för en bred vetenskaplig publik, inklusive de med begränsad tidigare erfarenhet av hMPCs. Vårt protokoll är bland de första som beskriver användningen av en avbildning flödescytometerns för att spåra cellpopulationer. Nydesignade Imaging flödescytometrar är State-of-the-art, hög genomströmning, och Microplate-baserade, möjliggör levande cell avbildning, cellräkning, och flerkanals fluorescens analys av alla celler i varje brunn av ett kultur fartyg inom några minuter. Detta system möjliggör en snabb kvantifiering av dynamiska förändringar i spridningen och livskraften hos en hel cellpopulation med endast minimala störningar i kulturen. Till exempel kan vi utföra objektiva mått av sammanflödet på på varandra följande dagar in vitro för att bestämma tillväxtkinetik av varje kultur som härrör från olika givare. Många protokoll i litteraturen, särskilt de som inbegriper differentiering av MPCs, kräver celler för att nå en definierad nivå av sammanflödet innan du påbörjar differentiering eller behandling7. Vår metod möjliggör objektiv bestämning av sammanflödet av varje brunn i ett kultur fartyg som gör det möjligt för forskare att initiera behandling på ett opartisk, icke-subjektivt sätt.
Tidigare var en stor begränsning av att använda primära hMPCs låg avkastning som begränsar antalet celler som är tillgängliga för experiment. Vi och andra har visat avkastningen av MPCs från skelettmuskel biopsi vävnad är 1 − 15 MPCs per milligram vävnad (figur 1)8. Eftersom vårt protokoll tillåter fyra passager av cellerna före rening med fluorescens aktiverad cell sortering (FACS), våra nedfrysta HMPC avkastning, som härrör från små mängder av biopsi vävnad (50 − 100 mg), är tillräckliga för att ta itu med forskningsmål där Det krävs flera experiment. Vår FACS-protokollet ger en ~ 80% ren (Pax7 positiv) MPC population, vilket vårt protokoll är optimerad för både avkastning och renhet.
Primära hMPCs är en viktig forskningsmodell som används för att förstå skelettmuskulaturen biologi och regenerativ process. Dessutom, hMPCs har potential att användas för behandling. Emellertid, det finns erkända utmaningar i att använda primära hMPCs för både forskning och terapi, inklusive begränsad förståelse av celler som härrör från människor10. Det finns också en stor grad av variation i expansions kapaciteten bland givar kulturer, vilket begränsar potentialen för anv?…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Cornell University, bioteknik Resource Center Imaging anläggning för deras hjälp med fluorescens aktiverad cell sortering. Vi tackar även Molly Gheller för hennes hjälp med deltagar rekrytering och Erica Bender för att utföra skelettmuskulaturen biopsier. Slutligen tackar vi deltagarna för deras tid och deltagande i studien. Detta arbete stöddes av det nationella institutet för åldrande av National Institutes of Health under tilldelning nummer R01AG058630 (till B.D.C. och A.E.T.), av en Glenn stiftelse för medicinsk forskning och American Federation for aging forskningsbidrag för Junior fakultet (till B . D.C.), och av presidentens råd för Cornell Women (till A.E.T.).
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
Penicillin/Streptomycin 100X Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |