힌들보 리 허 혈의 뮤린 모델에서 치료 혈관 신생 평가
Summary
여기에서, 중요한 뒷다리 허혈 실험 모형은 혈관 신생 치료의 효과를 평가하기 위하여 기능적, 적학 및 분자 시험의 건전지에 선행됩니다.
Abstract
중요한 사지 허혈은 (CLI) 더 낮은 사지 절단의 고위험을 수반하는 심각한 상태입니다. 금 표준 치료인 재혈관화에도 불구하고, 상당수의 CLI 환자는 외과적 또는 혈관내 혈관 혈관 혈관 혈관 화에 적합하지 않습니다. 혈관 신생 치료는 이 환자를 위한 선택권으로 나오고 있습니다 그러나 현재 조사되고 있습니다. 인간에 있는 신청의 앞에, 그 치료는 동물 모형에서 시험되어야 하고 그것의 기계장치는 명확하게 이해되어야 합니다. 뒷다리 허혈 (HLI)의 동물 모델은 쥐에서 말단 외부 불역및 대퇴 동맥 및 정맥의 결찰 및 절제에 의해 개발되었습니다. 기능, 기능학 및 분자 수준에서 허혈 및 가용 혈관 신생 요법의 효과를 평가하기 위해 포괄적 인 테스트 패널이 모였습니다. 레이저 도플러는 관류의 유량 측정 및 기능적 평가에 사용되었다. 조직 반응은 위장근육의 조직학적 섹션상에서 항 CD31 항체로 염색한 후 모세관 밀도를 분석하고 대각선 화 후 부수적인 혈관 밀도를 측정하여 평가하였다. 혈관신생 유전자의 발현은 쥐 위장관 근육으로부터 레이저 포획 미세내부를 포착한 후 내피 세포(ECs)에서만 선택된 혈관신생 인자를 대상으로 RT-PCR 표적화에 의해 정량화되었다. 이 방법은 허혈성 및 비 허혈성 사지 사이 그리고 처리되고 처리되지 않은 사지 사이 다름을 확인하는 에서 민감했습니다. 이 프로토콜은 CLI의 재현 가능한 모델과 혈관 신생 요법을 테스트하기위한 프레임 워크를 제공합니다.
Introduction
말초 동맥 질환 (PAD)은 주로 더 낮은 사지에 영향을 미칩니다. PAD는 동맥 경화증, 하반신의 혈류에 심각한 제한을 일으킬 수있는 동맥폐쇄에 의해 발생 1. 간헐적 파행은 PAD의 첫 번째 징후이며 걸을 때 근육 통을 말합니다. CLI는 PAD의 가장 가혹한 단계, 허혈성 나머지 통증, 궤양 또는 회지2를 보여주는 환자에서 진단되고. CLI를 가진 환자는 절단의 고위험이 있습니다, 치료되지 않는 경우에 특히3. 더 낮은 사지 revascularization (개천 수술 또는 혈관 내 절차에 의해) 현재 사지 회수를 달성하는 유일한 방법입니다. 그러나, CLI 환자의 약 30%는 병변의 위치, 동맥 폐색의 패턴 및 광범위한 동반변을 포함하는 이유로 이러한절차에 적합하지 않습니다 4,5. 그러므로, 혈관신생의 승진이 더 강렬한 조사에서 전략인 것과 더불어, 이 그렇지 않으면 치료할 수 없는 환자를 위해 새로운 치료가 필요합니다.
인간에서 테스트하기 전에 생체 내 새로운 치료법의 효과와 안전성을 동물 모델에서 고려해야 합니다. 몇몇 모형은 CLI의 연구 결과를 위해 개발되었습니다, 주로마우스6,7,8,9,10에있는 뒷다리 허혈 (HLI)를 유도하 여. 그러나, 이 모형은 결찰및/또는 절제되는 동맥의 본질 및 및 주위정맥 및 신경이 또한 6,7,8, 해부되는지 의 여부를 포함하여 몇몇 양상에서 다릅니다 9,10. 종합하면, 이러한 양상은 각 동물의 허혈 재관류 손상의 중증도에 영향을 미치므로 결과를 비교하기가 어렵습니다. 따라서, 허혈을 유도하는 절차와 다른 표적의 평가를 표준화하여 주어진 혈관신생 치료가 효과적일 지 여부를 평가하는 효과적인 프로토콜을 개발하는 것이 중요하다. 이러한 모든 측면을 커버하도록 설계된 실험 프로토콜은 혈관 신생 치료가 효과를 발휘하는 메커니즘과 각 결과에서 효능의 측정을 포괄적으로 이해할 수 있습니다. 우리 팀에 의해 최근에 간행된 2개의 명백한 일은 좋은 보기11,12,치료 혈관신생을 유도하기 위하여 다른 접근이 이것에 더 상세히 기술될 것이다 동일 프로토콜을 사용하여 평가되었다는 것을 프로토콜.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 CLI의 효과를 모방하고 가양성 혈관 신생의 기능적, 적학적 및 분자 적 효과에 대한 포괄적 인 평가를위한 실험 기반을 마련 할 수있는 재현 가능한 실험 모델을 설명하는 것입니다. 에이전트.
Protocol
Representative Results
Discussion
CLI의 뮤린 모델은 대부분 프로펀다 페모리스 4,5,6,7,8,9의 기원에 불과한 대퇴동맥의 결찰로 이루어져있다. 이것은 7 일 9안에 사지에 혈류량을 복구하는 부수적인 순환의 대부분을 그대로 두는 것을 보여주었습니다. 부수적 인 침?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 호세 리노와 타니아 카르발호, 생물 이미징 시설의 머리와 인스티투토 드 메디치나 분자 주앙 로보 Antunes의 조직학 및 비교 병리학 연구소의 머리, 각각 감사합니다. 우리는 또한 노바 의과 대학 / Faculdade 드 Ciências 메디카스, 유니버시 다드 노바 드 리스보아의 해부학학과에서 Vyacheslav Sushchyk 감사합니다.
자금 지원 참조: UID/IC/0306/2016 Fundação 파라 a Ciência e a Tecnologia에 의해 투자된 프로젝트. 폴라 드 올리베이라는 Fundação 파라 아 시에엔시아 e 테크놀로지아에서 펠로우십(SFRH/BD/80483/2011)에 의해 지원됩니다.
Materials
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution – nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution – toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution – toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
