우리는 마우스 간에서 담관 밀도의 정확한 정량화를 위한 다소 간단하고 민감한 방법을 제시합니다. 이 방법은 유전 및 환경 수정자의 효과와 담즙 질환의 마우스 모델에서 잠재적 인 치료의 효과를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
마우스는 담즙 질병을 연구하는 모형 유기체로 광범위하게 이용됩니다. 담즙 계통의 발달 그리고 기능을 평가하기 위하여는, 특정 마커를 위한 혈청 화학, 조직학 분석 및 면역 얼룩을 포함하여 각종 기술이 이용됩니다. 이 기술은 담즙 시스템에 관하여 중요한 정보를 제공할 수 있더라도, 그(것)들은 수시로 전체 간을 통해 담관 (BD) 발달 결함의 전체 그림을 제시하지 않습니다. 이것은 부분적으로 담 즙 개발에 상당한 장애를 가진 동물에서 담 즙을 배출 하는 마우스 간의 강력한 능력 때문. 여기에서 우리는 돌연변이/형질전환 마우스의 모든 로브를 포함하는 단면도에 있는 각 문맥 (PV)와 관련되었던 BDs의 평균 수를 계산하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법에서는, 간은 각종 유전형 및 실험 조건 사이 비교를 용이하게 하기 위하여 입체적인 방식으로 거치되고 단면화됩니다. BDs는 세포각증 염색 담관옥시의 가벼운 현미경 검사를 통해 확인된 다음 간 절편에 존재하는 총 PV 수로 계산및 분할됩니다. 예를 들어, 우리는이 방법이 명확하게 야생 형 마우스와 Alagille 증후군의 마우스 모델을 구별 할 수있는 방법을 보여줍니다. 여기에 제시된 방법은 담즙 나무의 3 차원 구조를 시각화하는 기술을 대체 할 수 없습니다. 그러나, BD 발달 및 마우스에 있는 연성 반응 대형의 정도를 정량적으로 평가하는 쉽고 직접적인 방법을 제공합니다.
서론
담즙 나무는 포유류 간에서 중요 한 부분, 창 자에 간 세포에서 담 즙의 통과 허용. 간간 간 담관 (BDs)은 융기양양에 의해 형성되며, 이는 노치 및 TGFβ 신호전달을통해 이중 전위 간폭발과 구별되는 1,2. 성숙한 BD에 담관과 그들의 어셈블리의 적당한 명세서 그리고 투입은 간 간 담즙 나무의 발달을 위해 중요합니다. 간 개발 또는 장기 재생 시 성장, 담 즙 시스템 적절 한 담 즙 배수를 보장 하기 위해 간 따라 개발 해야. 더욱이, 많은 신디로믹 및 비 신드로믹 질환은 간간 BDs3의빈약성을 초래한다. 또한, 다수의 급성 및 만성 간 질환은 담즙 마커를 발현하지만 담즙 세포 또는 형태에서 반드시 발생하지 않는 상당수의 세포의 존재로 정의되는 간에서 소위 연성 반응을 초래합니다. 특허 BDs4. 다중시스템 장애인 알라길증후군(ALGS)에서, 노치 리간드의 하플로인스실핍증1(JAG1)은BD 형성이 불량하고 담즙정체증5,6. 우리의 실험실은 최근에 이전에 생성 된 Jag1....
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프로토콜
모든 동물은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침및 승인된 동물 프로토콜에 따라 베일러 의과 대학의 장벽 동물 시설에 보관되었습니다.
1. 마우스 간 조직의 컬렉션
-
간 수확을위한 마우스의 준비
- 이소플루란을 사용하여 마우스를 안락사시.
- 죽음을 보장하기 위해 마우스의 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
- 흉곽 아래 약 1인치 의 가로 절개를 합니다.
- 간 전체 복부 표면을 노출시면
-
마우스 간 수집
- 조심스럽게 작은 가위로 간을 복부의 다른 장기로 연결하는 인대를 잘라냅니다.
- 일반적인 BD를 통해 잘라 장에서 간을 분리합니다.
- 조심스럽게 담낭에 개최하여 간을 제거하고 즉시 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 의해 3 분기에 채워진 50 mL 튜브에 배치합니다.
2. 파라핀에 간 을 고정하고 포함
-
고정
- 4 °C에서 4% PFA에서 48 시간 동안 간 조직....
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결과
우리는 이전에 Jag1 +/-동물, ALGS8의마우스 모델에서 담즙 결함을 문서화했습니다. BD 대 PV 비율을 결정하기 위해, 우리는 P30 마우스 간을 절제하고 혈관 마커 αSMA와 함께 CK8 및 CK19 (wsCK)를 위해 그들을 공동 염색했습니다. 그런 다음 각 간 엽의 모든 PV를 이미지화했습니다. 그림 2A에나타난 바와 같이, 우리는 인접한 wsCK 염색 (화살촉)이있는 αSMA 염색 용기로 PV를 정의했습니다. wsCK가 없는 αSMA 염색 구조는 중앙 정맥이었으며 분석(화살표)에 포함되어서는 안 됩니다.
일단 PV가 확인되면, 우리는 그들의 특징적인 모양에 의하여 특허 BD를 확인했습니다. 그림
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토론
마우스에서 BD 발달 및 수리의 분석은 담대성 무질서의 병인 그리고 기계장치를 공부에 있는 중요한 공구입니다. 또한, 새로운 치료법의 개발은 부분적으로 재현가능하고 바람직하게는 정량화 가능한 표현형을 확립하는 데 의존한다. 마우스 모형에 있는 현재 표현형은 일반적으로 세포 모형 특정 마커를 위한 혈청 화학, 간 신체 학 및 면역 염색을 관련시킵니다. 이러한 기술은 담즙 시스템의 구조와 기능에 대한 귀중한 정보를 생성하지만, 그들은 BDs의 수에 주어진 유전자 조작의 효과의 직접적인 측정을 제공하지 않습니다. 해부학 병리학에서, 인간 환자의 BD 빈곤은 생검 섹션 9에서 BD 대 PV비율의 분석을 통해 결정됩니다. 임상의가 ALGS 및 그밖 담즙정체성 질병에 있는 담즙 정체및 간 질병의 엄격을 결정하기 위하여 혈청 화학 분석을 채택하는 동안18,19,마우스 모형에 있는 조직학 평가는 .......
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공개 사항
저자는 이해상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 국립 보건원 (NIH)의 지원을 인정 (R01 GM084135 및 R01 DK109982), NIH P30 DK56338에서 텍사스 의료 센터 소화기 질환 센터에서 파일럿 / 타당성 상, 그리고 알라질 증후군 가속기 상에서 의료 재단.
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재료
이, , , , 로지스
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 소테시아(이소플루란) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| 데시케이터 | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | 전자 현미경 과학 | 15712 | |
| 50 mL 튜브 | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% 에탄올 | 데콘 실험실 | 2401 | |
| 95% 에탄올 | 데콘 실험실 | 2801 | |
| 100% 에탄올 | Decon 실험실 | 2701 | |
| HistoChoice | VWR 생명 과학 | H103-4L | 청산소, |
| 옴니제트 조직 카세트 | 피셔 헬스케어 | 15-197-710E | |
| , Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast, X-TRA, | McCormick Scientific | 39503002 | 파라핀 |
| 조직 곰팡이 | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| 마이크로톰 | 미크론 | HM 325 | |
| Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 크실렌 | Fisher Scientific | C8H10 | |
| 트리스 기반 항원 검색 | 벡터 실험실 | H-3301 | |
| 압력 밥솥 | 인스턴트팟 | 럭스 미니 | |
| 미니 파프 펜 | 라이프 테크놀 | 8877 | |
| 폴리옥시에틸렌 20 소르비탄 모노라우레이트(트윈-20) | J.T. 베이커 | X251-07 | |
| 옥틸 페놀 에톡실레이트(트리톤-X-100) | J.T. 베이커 | X198-07 | |
| 노멀 염소 세럼 | 잭슨 면역연구 | 005-000-121 | |
| 안티-CK8 | 발달 연구 Hybridoma Bank | TROMA-I | 항체 등록 ID AB531826 |
| anti-CK19 | 발달 연구 Hybridoma Bank | TROMA-III | 항체 등록 ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22 x 50 mm2 마이크로 커버 유리 | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| 형광 현미경 | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | 안티페이드 마운팅 매체 |
참고문헌
- Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
- Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision b....
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