Aquí se describe un procedimiento quirúrgico que muestra cómo lograr la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente izquierda-anterior en ratones. Este modelo es de gran relevancia para investigar la fisiopatología del infarto de miocardio y los procesos biológicos concomitantes.
El infarto de miocardio (MI) y las enfermedades coronarias agudas se encuentran entre las causas más prominentes de muerte en población con estilo de vida occidental. Los modelos murinos de MI con ligadura permanente de la arteria coronaria descendente izquierda-anterior (LAD) imitan estrechamente a LA en humanos. Los modelos murinos se benefician de la extensa ingeniería genética disponible en la industria actual. Aquí proponemos un modelo quirúrgico murino reproducible de infarto de miocardio por ligadura coronaria permanente LAD. Nuestra técnica comprende anestesia con ketamina/xilazina que se puede revertir rápidamente mediante la administración de un antagonista, intubación sin traqueotomía para ventilación asistida mecánicamente, ventilación con aplicación de positivo extríntico presión espiratoria final (PEEP) para evitar el colapso alveolar, un método de toracotomía que limita a las lesiones quirúrgicas mínimas hechas a los músculos esqueléticos, y la inflación pulmonar sin toracentesis. Este método es escasamente invasivo, reproducible y reduce la mortalidad y complicaciones posteriores a la cirugía.
El infarto agudo de miocardio (MI) es la expresión más grave de enfermedades isquémicas del corazón (IHD). La IHD es la principal causa de morbilidad y muerte en todo el mundo, especialmente en los países occidentales1. En consecuencia, tiene un enorme impacto económico en los sistemas sanitarios2. MI se caracteriza por la oclusión de una arteria coronaria por placa aterosclerótica y la posterior detención del flujo sanguíneo en grandes partes del miocardio. La falta de suministro de oxígeno en el miocardio conduce a la muerte isquémica de los cardiomiocitos. Esta condición patológica desencadena respuestas en el tejido ventricular que en última instancia conduce a deficiencias en las funciones ventriculares, remodelación e insuficiencia cardíaca3. LA MI es una condición fisiopatológica compleja que implica múltiples e intrincados procesos biológicos que comprenden la muerte celular regulada, respuesta al estrés oxidativo, inflamación, cicatrización de heridas, fibrosis y remodelación ventricular. Algunas de estas respuestas biológicas se modelan como procesos individuales in vitro como la liberación inducida por necrosis de patrones moleculares asociados al daño y las respuestas inflamatorias asociadas4. Estos modelos simplificados son esenciales para entender MI. Sin embargo, sólo un modelo in vivo puede proporcionar una imagen realista de la complejidad de los procesos biológicos involucrados en respuesta a MI.
A pesar de que los modelos de MI en animales más grandes como los cerdos pueden relacionarse más estrechamente con la fisiopatología humana de MI, el poder de los modelos murinos reside en las posibilidades que ofrece la ingeniería genética que es más avanzada que en cualquier otra especie de mamífero. Otros aspectos no despreciables son el bajo costo relativo y la simplicidad de la configuración quirúrgica.
Vale la pena mencionar que los modelos de isquemia-reperfusión del miocardio pueden exhibir resultados diferentes a los modelos de MI permanentes. Los procesos biológicos como el tipo de muerte celular comprometida, la calidad/amplitud o la cinéticade las respuestas inflamatorias y cicatrizantes de heridas en el tejido miocárdico pueden variar según el modelo 5,6,7. Sin embargo, este protocolo de oclusión coronaria permanente se puede adaptar fácilmente para obtener un modelo de isquemia-reperfusión.
Este método es relevante para estudios relacionados con la fisiopatología de la MI sin reperfusión y permite el seguimiento de los procesos patológicos que ocurren desde la oclusión coronaria (minutos) hasta la insuficiencia cardíaca tardía (semanas) en el tejido cardíaco local y sistémico Niveles.
El primer paso crítico de este procedimiento es sin duda la intubación. Usamos la aguja interna contundente de un catéter de 16 G como tubo traqueal. No recomendamos el uso de esta configuración con ratones que pesan menos de 22 g. Con esta configuración, puede ser difícil intubar ratones correctamente con un peso corporal más pequeño sin dañar la tráquea. Otro punto crítico es limitar las incisiones realizadas en el músculo mientras se expone la tráquea y la caja torácica. Reducir el daño tisular es de gran importancia, especialmente cuando se estudian los procesos inflamatorios posteriores a la MI. Es por eso que preferimos la difusión suave demúsculo y costillas con fórceps y retractores 8,9. No utilizamos cauterizador eléctrico para controlar el sangrado10. Esto puede causar quemaduras iatrogénicas y favorecer infecciones. Tanto el trauma como las infecciones pueden sesgar las lecturas inflamatorias. La aplicación de un PEEP extrínseco de 3 cm H2O hundiendo el escape de ventilación en un tubo de agua limita el colapso alveolar espiratorio final durante la toracotomía. La localización de la LAD es otro paso crítico y hay que tener en cuenta que la anatomía de las arterias coronarias puede variar dependiendo de la cepa y el genotipo del ratón11. Requiere cierta experiencia para visualizar el LAD, sin embargo, colocar la sutura directamente 2-3 mm por debajo de las arículas izquierdas como se describe en el procedimiento permitirá el posicionamiento correcto de la ligadura. La decoloración instantánea de grandes porciones del ventrículo izquierdo bajo la sutura confirma la precisión. Por último, la aplicación artificial de auto-PEEP bloqueando el escape de ventilación para 2-3 ciclos respiratorios durante el cierre torácico permite una hiperinflación transitoria del pulmón que ayudará a perseguir el aire de la cavidad torácica12. No realizamos a propósito una toracentesis como se muestra en 9,10. De esta manera, limitamos el riesgo de lesiones pulmonares y cardíacas y evitamos daños excesivos en los tejidos o perforaciones.
Isquemia-reperfusión miocárdica (I/R) es un modelo quirúrgico relacionado que imita la restauración del flujo sanguíneo coronario que se realiza a los pacientes con MI en las clínicas. Durante el modelo de I/R se realiza una oclusión transitoria de la arteria coronaria apretando un tubo enel LAD durante una duración de 20 a 45 min 8,13. A continuación, la oclusión se libera para permitir la reperfusión del miocardio durante la duración deseada. Esta simple modificación aplicada a nuestro protocolo puede convertirlo fácilmente en un modelo4de I/R,8,14,15. El infarto puede ser confirmado por un análisis de sangre para la troponina cardíaca T8,10 o por ecocardiografía15.
MI difiere del modelo de I/R porque la reperfusión por sí misma induce una lesión. MI induce más necrosis tisular y la apoptosis es más pronunciada en el miocardio reperfusodo5. La cinética de la infiltración de células inflamatorias también es diferente entre en MI e IR con una infiltración miocárdica retardada de células inmunitarias en MI7. El tamaño y la posición del área infarte también diferirán entre la ligadura permanente y los modelos de I/R15. Teniendo esto en cuenta, hay que tener cuidado de elegir un modelo relevante, ya que los modelos de I/R y MI permanente no son equivalentes. Otro modelo murino del infarto de miocardio es el modelo de crioinfarción. La aplicación de una sonda criogénica en la pared anterior del LV induce la congelación del tejido ventricular y el detención del flujo sanguíneo en la arteria LAD. Esta técnica sin embargo difiere de las técnicas DE MI e I/R en cuanto a la sincronización y amplitud de la remodelación y las respuestas inflamatorias16,17.
La variabilidad es una limitación en cuanto a cualquier procedimiento quirúrgico. Esta variabilidad se basa en diferencias biológicas. Un buen ejemplo es la variación en la disposición arterial coronaria en ratones11. También se basa en las habilidades del experimentador. Vale la pena mencionar que la formación adecuada de los experimentadores es obligatoria para alcanzar resultados estables con este modelo. Un experimentador bien entrenado puede producir fácilmente tamaños de infarto sorreproducibles (Figura3A-B). La mortalidad del modelo depende de la posición del LAD, la duración de los experimentos (días, semanas), la tensión del ratón y los genotipos. Los tipos de analgésicos y analgésicos también pueden afectar el resultado de los experimentos con efectos cardioprotectores o cardiodepresores putativos. En nuestras manos, este modelo tiene una tasa de mortalidad global del 25-30%. Esta tasa de mortalidad comprende muertes espontáneas y sacrificios antes del final del experimento, independientemente de las cepas y la duración del experimento. La mayoría de las muertes o sacrificios son entre el segundo y cuarto día después de la cirugía. La aplicación de un estricto manejo del dolor y el seguimiento de los animales puede reducir la mortalidad.
Aquí presentamos resultados representativos del tamaño del infarto analizados utilizando la tinción TTC y la expresión de proteínas y genes implicados en procesos inflamatorios o fibrosos en LV por western blot y PCR en tiempo real respectivamente (Figura3C-G). También es posible medir muchos de estos parámetros mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o ensayos enzimáticos. Por supuesto, de acuerdo con la hipótesis que necesita ser probado, este método puede ser seguido por cualquier análisis funcional por ultrasonido, RMN o medición del catéter intraventricular de presión y volumen. También es posible extraer el corazón e investigar más a fondo la biología de las células cardíacas en células aisladas. En general, el modelo MI con ligadura permanente de la arteria coronaria LAD es particularmente útil para evaluar procesos inflamatorios y fibrosos, cicatrización de heridas y cambios en la función cardíaca posteriores al infarto de miocardio.
The authors have nothing to disclose.
Este modelo fue desarrollado con el apoyo de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias (Grants 310030_162629 to LL) y fondos departamentales de los Servicios de Cirugía Torácica y Medicina de Cuidados Intensivos del Hospital Universitario de Lausana. JL recibe una beca de la Fundación Emma Muschamp. Reconocemos el apoyo crucial de los veterinarios y el personal de instalaciones de animales de la Facultad de Biología y Medicina de la Universidad de Lausana. Agradecemos a la Dra. Giuseppina Milano del Servicio de Cirugía Cardíaca del Hospital Universitario de Lausana y al Dr. Alexandre Sarre de Evaluación Cardiovascular Facilty de la Universidad de Lausana por sus consejos técnicos.
1 CC Syringe, Omnifix-F | B. Braun | 9161406V | |
30G- Needle | BD Microlance 3 | 304000 | |
70% Ethanol | |||
Betadine 60 ml | MundiPharma | ||
Blunt Retractors | Fine Science Tools | 18200-09 | |
Castroviejo Needle Holder Straight with Lock | Roboz | RS-6416 | |
Cotton Swabs | Applimed SA | 6001109 | |
Dissecting Scissors, Curved | Aesculap | BC603R | |
Electrical Razor | Remington | HC720 | |
Glucose 5% B.Braun | B. Braun | 531032 | |
Hair Removal Cream, Veet | Silk & Fresh Tech. | 8218535 | |
Iris Dissecting Forceps Full Curved | Aesculap | OC022R | |
Ketasol 100 (100 mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN01AX03 | |
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NaCl 0.9% B. Braun | B. Braun | 534534 | |
Short Fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
Silk Suture 5-0, BB | Ethicon | K880H | |
Silk Suture 6-0, P-1 | Ethicon | 639H | |
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Tracheal tube inner needle of an 16G i.v. cat | Abbocath-T | G714-A01 | |
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Ventilator, MiniVent Model 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
Viscotears | Alcon | 1551535 | |
Xylasol (1mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN05CM92 |