Uttryck och rening av Nukleasfri syre avskiljare Protocatechuat 3, 4-dioxygenas
Summary
Protocatechuat 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatiskt avlägsna fritt diatomärt syre från ett vattensystem med hjälp av dess substrat protocatechuic Acid (PCA). Detta protokoll beskriver uttrycket, renings-och aktivitets analysen av detta enzym för syre rensning.
Abstract
Single molekyl (SM) mikroskopi används i studiet av dynamiska molekylära interaktioner av fluorophore märkta biomolekyler i realtid. Fluoroforer är dock utsatta för förlust av signal via foto blekning genom upplöst syre (O2). För att förhindra foto blekning och förlänga fluorofores livstid används syre rensnings system (OSS) för att minska O2. Kommersiellt tillgängliga OSS kan vara förorenade av nukleaser som skadar eller försämrar nukleinsyror, confounding tolkning av experimentella resultat. Här specificerar vi ett protokoll för uttryck och rening av mycket aktiva Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) utan påvisbara nukleasförorening. PCD kan effektivt avlägsna reaktiva O2 arter genom omvandling av substratet protocatechuic Acid (PCA) till 3-karboxy-CIS, CIS-mukonsyra. Denna metod kan användas i alla vattensystem där O2 spelar en skadlig roll i datainsamling. Denna metod är effektiv i att producera mycket aktiva, Nuclease gratis PCD i jämförelse med kommersiellt tillgänglig PCD.
Introduction
En enda molekyl (SM) biofysik är ett snabbt växande område som förändrar hur vi ser på biologiska fenomen. Detta område har den unika förmågan att koppla grundläggande fysikens lagar och kemi till biologi. Fluorescens-mikroskopi är en biofysisk metod som kan uppnå SM-känslighet. Fluorescens används för att detektera biomolekyler genom att länka dem till små organiska fluorofomedel eller kvantprickar1. Dessa molekyler kan avge fotoner när upphetsad av lasrar innan photoblekning oåterkalleligt2. Photoblekning uppstår när fluorescerande etiketter genomgår kemisk skada som förstör deras förmåga att excitera vid önskad våglängd2,3. Förekomst av reaktiva syreradikaler (ros) i vattenbuffert är en primär orsak till foto blekning2,4. Dessutom kan ros skada biomolekyler och leda till felaktiga observationer i SM-experiment5,6. För att förhindra oxidativ skada kan syre rensnings system (oss) användas3,7,8. Glukos oxidas/catalase (GODCAT) systemet är effektivt på att ta bort syre8, men det producerar potentiellt skadliga peroxider som intermediärer. Dessa kan vara skadliga för biomolekyler av intresse för SM-studier.
Alternativt, protocatechuate 3, 4 dioxygenas (PCD) kommer effektivt att ta bort O2 från en vattenlösning med hjälp av dess substrat protocatechuic syra (PCA)7,9. PCD är ett metalloenzym som använder höjare järn för att samordna PCA och katalysera katekol ring öppnings reaktionen med hjälp av upplöst O210. Detta ett steg reaktion visar sig vara en övergripande bättre OSS för att förbättra fluorophore stabilitet i SM experiment7. Tyvärr innehåller många kommersiellt tillgängliga OSS-enzymer, inklusive PCD, kontaminerande nukleaser11. Dessa föroreningar kan leda till skador av nukleinsyra-baserade substrat som används i SM experiment. Detta arbete kommer att belysa ett kromatografibaserat renings protokoll för användning av rekombinant PCD i SM-system. PCD kan tillämpas i stor utsträckning på alla experiment där ROS är skadliga substrat som behövs för datainsamling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syre rensning system ingår vanligen i Single molekylens fluorescens mikroskopi att minska photoblekning3,7,8. Dessa mikroskopi tekniker används ofta för att observera nukleinsyror eller protein interaktioner med nukleinsyror1,13,14. Kontaminering av OSSs med nukleaser kan leda till falska resultat.
Kommers…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH GM121284 och AI126742 till KEY.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
- Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
- Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).
