스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

요약

여기서, 우리는 1차 섬유아세포를 이용한 시험관내 스크래치 분석및 마우스에서 의 피부 상처 치유 분석실험을 위한 프로토콜을 제시한다. 두 방법 모두 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 평가하는 간단한 방법입니다.

초록

손상된 절단 상처 치유는 당뇨병을 앓고있는 환자와 노인에게 중요한 관심사이며 효과적인 치료가 필요합니다. 적절한 생체외 및 생체내 접근법은 피부 상처 치유 과정을 개선하기 위한 약물 치료를 위한 새로운 표적 분자의 식별에 필수적이다. 우리는 전압 게이트 칼슘 채널 (Cavβ3)의 β3 소단위를 두 개의 독립적 인 분석법, 즉 생체 외 스크래치 이동 분석 및 생체 내 등쪽 피부 접힘 챔버 모델에서 상처 치유에 영향을 미치는 잠재적 인 표적 분자로 확인했습니다. 1 차 마우스 배아 섬유아세포 (MEFs) 야생 형 (WT) 및 Cavβ3 결핍 마우스 (Cavβ3 KO) 또는 SiRNA로 처리 된 WT 마우스로부터 급성으로 분리 된 섬유 아세포는 Cacnb3 유전자의 발현을 하향 조절합니다. , Cavβ3을 인코딩하여 사용했습니다. 스크래치는 결합 된 세포 단층에 적용하고 갭 클로저는 마이그레이션 셀에 의해 갭의 완전한 재모독까지 정의 된 시점에서 현미경 이미지를 복용하여 뒤따랐다. 이들 이미지는 분석되었고, 각 조건에 대해 세포 이동 속도를 결정하였습니다. 생체 내 분석에서, 우리는 WT와 Cavβ3 KO 마우스에 등쪽 피부 접이식 챔버를 이식하고, 직경 2mm의 정의된 원형 상처를 적용하고, 감염및 탈수로부터 보호하기 위해 유리 커버 슬립으로 상처를 덮고, 거시적 상처 폐쇄를 모니터링했습니다. 시간이 지남에 따라. 상처 폐쇄는 Cacnb3-유전자결핍 마우스에서 상당히 빨랐다. 생체외 분석의 결과는 생체외 분석과 상관관계가 잘 연관되기 때문에, 시험관내 분석노는 생체내 상처 치유 모델에 의한 시험관 내 안타를 검증하기 전에 높은 처리량 스크리닝에 유용할 수 있다. 우리가 야생형 및 Cavβ3 결핍 마우스 또는 세포를 위해 여기에서 보여준 것은 또한 Cavβ3 이외에 특정 분자를 위해 적용될 수 있습니다.

서론

피부 상처 치유는 피부의 무결성을 회복하고 감염으로부터 유기체를 보호하기 위해 피부 손상 직후에 시작됩니다. 상처 치유 과정은 네 개의 겹치는 단계를 거칩니다. 응고, 염증, 새로운 조직 형성 및 조직 리모델링^1. 세포 마이그레이션은 이러한 단계에서 매우 중요합니다. 염증성 세포, 면역 세포, 각질 세포, 내피 세포 및 섬유아세포는 상이한 시점에서 활성화되고 상처 부위^2를침범한다. 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 조사하는 방법은 근본적인 메커니즘을 이해하는 것뿐만 아니라 새로운 약물을 테스트하고 피부 상처 치유를 개량하고 가속화하는 것을 목표로하는 새로운 전략을 개발하는 데 큰 관심이 있습니다.

셀 마이그레이션을 모니터링하고 분석하기 위해 스크래치 마이그레이션 분석을 사용할 수 있습니다. 그것은 종종 시험관 내 상처 치유 분석이라고합니다. 이 방법은 세포 배양 시설^3을필요로 한다. 그것은 간단한 절차이고, 고급 장비의 필요가 없고 대부분의 세포 생물학 실험실에서 분석이 수행될 수 있습니다. 이 분석에서, 무세포 영역은 동봉된 세포 단층, 바람직하게는 상피-또는 내피 유사 세포 또는 섬유아세포의 기계적 파괴에 의해....

프로토콜

모든 실험 절차는 자를란트 와 자를란트 대학의 윤리 규정 및 동물 복지위원회에 따라 승인되고 수행되었습니다.

1 1 1 차적인 세포 배양 및 siRNA 형질감염

참고 : 설명 된 방법에서 1 차 섬유 아세포가 사용됩니다. 이들 세포는 상처 치유 및 조직 리모델링^11에중요한 역할을 한다. 본 실험에서, Cacnb3 유전자는, 고전압 게이트 칼슘^{채널(12)의} Cavβ3 소단위를 코딩하여 하향 조절되었고, 이에 따라 생체내 세포 이동 및 피부 상처 수리에 그 역할을 나타내고^4.

1. siRNA의 준비: siRNAs를 재구성하기 전에, 내용이 바닥에 있는지 확인하기 위해 튜브를 잠시 원심 분리합니다. 100 μL RNase-free 버퍼(100 mM 칼륨 아세테이트, 30 mM HEPES, pH 7.5)에서 siRNAs를 20 μM의 농도로 재구성합니다. 이것은 siRNAs의 재고 솔루션입니다.
2. Aliquot 이 스톡 용액은 튜브당 10 μL(20 μM 농도)에서 사용될 때까지 -20°C에서 보관합니다.
3. 초미세....

결과

스크래치 분석은 야생형 및 β3 결핍 MEFs의 동시 세포 단층상에서 수행하였다(도1c). 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 "스크래치"를 수행 한 후, 두 유전형의 세포가 스크래치 영역으로 이동하고 간격을 닫습니다. 이미지는 6, 10 및 30시간 후에 촬영하였다(도1a). 셀 마이그레이션을 백분율(%)으로 정량화했습니다. 스크래치 를 수행한 후 6시간 후에 셀을 마이그레이션하여 다시 채워진 스크래치 영역입니다. Cavβ3 결핍 MEF를 마이그레이션하는 것은 야생 형 마우스로부터의 MEF보다 훨씬 일찍 스크래치 영역을 폐쇄하였다(그림1a,b). 세포 증식의 임의의 효과를 배제하기 위해, 스크래치 마이그레이션 분석기는 10% 또는 1% FCS의 존재 에서 수행되었다. 10% FCS.......

토론

이 원고에서, 우리는 생체 외 및 생체 내 상처 치유 분석기를 설명하고 얻어진 결과를 상관시상한다. 시험관내 분석의 경우, 1차 마우스 섬유아세포^4,14,15를 사용하였으며 이는 상처 치유 및 조직 리모델링에 중요한 역할을 한다^11. 단층으로 성장하는 다른 부착 세포 유형 (예를 들어, 상피 세포, 내피 세포, 각질 세포)도 사용할 수 있습니다. 정확하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해서는 동일한 수의 생존 가능하고 건강한 세포를 도금하고 동일한 수준의 컨플루시로 스크래치를 적용하는 것이 가장 중요합니다. 생물학적 및 기술적 복제를 수행하는 것이 좋습니다. 본 방법에서는 6 웰 플레이트가 사용되었지만 12- 또는 24 웰 플레이트는 특히 제한된 수의 셀만 사용할 수있는 경우에도 사용할 수 있습니다. siRNA 처리의 경우에.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.9 % NaCl
1 ml 주사기	BD Plastipak	303172
6 웰 플레이트	Corning	3516
생검 펀치	Kai Industries	48201	2 mm
Cacnb3 마우스 siRNA Oligo Duplex (궤적 ID 12297)	Origene	SR415626
탈모 크림			모든 탈모 크림
덱스판테놀 5% (베판텐)	바이엘	3400935940179.00	(베판텐)
디하이드록실리디노티아진 염산염(자일라진)	바이엘 헬스케어		롬푼 2%
둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)	생명 과학의 기브코	41966-029
태아 소 혈청	깁코 생명 과학의 생명 기술	10270-106
육각형 전체 너트
케타민 염산염	Zoetis		KETASET
광학 현미경	Keyence, Osaka, Japan	BZ-8000	유사한 현미경을 사용할 수 있습니다
Lipofectamine RNAiMAX 트랜스펙션 시약	Thermo Fisher Scientific	13778075
Micro-byps
Micro-Scissors
마우스 구속 장치	집에서 만든
일반 가위
오브젝티브	니콘	계획 apo 10x/0.45
Opti-MEM	Gibco by life technologies	51985-026
폴리 프로필렌 봉합
스크루 드라이버
스킨 소독제 (octeniderm)	Sch ü LKE & Mayr GmbH	118212
슬롯 치즈 헤드 스크류
스냅 링
스냅 링 플라이어
카메라가 있는 수술용 현미경	라이카	라이카 M651
스킨폴드 챔버용 티타늄 프레임	IROLA	160001	Halteblech M
와이어 파일러

사