Funzionalizzazione dei cantilever a microscopio a forza atomica con cellule A T singole o a particella singola per la spettroscopia immunologica a forza a cella singola
Summary
Presentiamo un protocollo per funzionalizzare i cantilever a forza atomica (AFM) con una singola cellula T e particelle di perline per studi immunologici. Vengono mostrate le procedure per sondare il legame di cellula-cellula T a una singola coppia da parte di AFM e per monitorare la risposta cellulare in tempo reale dei macrofagi a una singola particella solida da AFM con imaging a fluorescenza.
Abstract
La spettroscopia a forza cellulare atomica (AFM-SCFS) è un potente strumento per studiare le proprietà biofisiche delle cellule viventi. Questa tecnica consente di sondare i punti di forza e la dinamica di interazione su una membrana cellulare viva, compresi quelli tra le cellule, il recettore e i ligandi, e insieme a molte altre variazioni. Funziona anche come meccanismo per fornire uno stimolo fisico o biochimico su singole cellule in modo spatiotemporalmente controllato, consentendo così l’attivazione di cellule specifiche e i successivi eventi cellulari da monitorare in tempo reale quando combinati con le cellule vive l’imaging a fluorescenza. Il passo chiave in queste misurazioni AFM-SCFS è la funzionalizzazione a sbalzo AFM, o in altre parole, allegando un argomento di interesse al cantilever. Qui, presentiamo metodi per modificare i cantilever AFM con una singola cellula T e una singola perla di polistirolo rispettivamente per gli studi immunologici. Il primo prevede una colla biocompatibile che associa singole cellule T alla punta di uno sbalzo piatto in una soluzione, mentre la seconda si basa su una colla epossidica per l’adesione a perline singola nell’ambiente atmosferico. Vengono fornite anche due applicazioni immunologiche associate a ogni modifica a sbalzo. I metodi qui descritti possono essere facilmente adattati a diversi tipi di cellule e particelle solide.
Introduction
La microscopia a forza atomica (AFM), uno strumento versatile, ha trovato molte applicazioni nella ricerca sulla biologia cellulare1,2,3,4,5. Oltre alla sua capacità di imaging ad alta risoluzione, la funzione nativa di sonda di forza consente di studiare direttamente le proprietà biofisiche delle cellule viventi in situ al livello a cella singola6,7. Questi includono le rigidità delle strutture subcellulari o anche le cellule intere8,9,10,11,12, specifici punti di forza di legamento / recettore livello di singola molecola sulla superficie cellulare13, e le forze di adesione tra singole coppie di particelle solide e cellule o tra due cellule1,2,14,15. Questi ultimi due sono spesso classificati come spettroscopia a forza singola (SCFS)16. A causa dei cantilever prontamente disponibili con varie costanti primaverili, la gamma di forza accessibile all’AFM è piuttosto ampia da pochi piconewtons (pN) a micronewton (N), che copre adeguatamente l’intera gamma di eventi cellulari che coinvolgono forze di poche decine di pN, come il legame a singola molecola basato sul recettore, a nN, come gli eventi cellulari fagocitici15. Questa vasta gamma di forza dinamica rende l’AFM vantaggioso rispetto ad altre tecniche di sonda di forza come le pinzette ottiche/magnetiche e una sonda di forza biomembrana, in quanto sono più adatte per misurazioni a forza debole, con forza tipicamente inferiore a 200 pN17 , 18.Inoltre, l’AFM può funzionare come manipolatore ad alta precisione per fornire vari stimoli su singole celle in modo spatiotemporale4,19. Questo è auspicabile per gli studi di attivazione di una singola cellula in tempo reale. In combinazione con l’imaging a fluorescenza delle cellule vive, la successiva risposta cellulare allo stimolo specifico può essere monitorata contemporaneamente, rendendo così SCFS basato su AFM estremamente robusto come imaging ottico che fornisce uno strumento pratico per sondare la segnalazione cellulare. Per esempio, AFM è stato utilizzato per determinare i ceppi necessari per suscitare transitori di calcio negli osteoblasti20. In questo lavoro, i transitori di calcio sono stati tracciati fluorescente attraverso l’imaging ratiometrico del calcio dopo l’applicazione di forze localizzate su osteoblasti coltivati con una punta AFM. Recentemente, AFM è stato impiegato per allungare fibrille di collagene su cui sono state coltivate cellule epatiche stellate (HSC) e questa attivazione di HSC trassedanti mechano è stata monitorata in tempo reale da un biosensore Src fluorescente, la cui fosforolazione come l’intensità di fluorescenza del biosensore è correlata all’attivazione HSC3.
Negli esperimenti SCFS basati su AFM, una corretta funzionalizzazione dei cantilever AFM è un passo fondamentale verso misurazioni di successo. Dal momento che il nostro interesse di ricerca si concentra sull’attivazione delle cellule immunitarie, abbiamo regolarmente funzionalizzante i sbalzioni con particolato come singole particelle solide che possono innescare la fagocitosi e/o forti risposte immunitarie4,14 , 15 e singole cellule T che possono formare una sinapsi immunitaria con antigene che presenta cellule, come le cellule dendritiche attivate (DC)2. Le singole particelle solide sono normalmente accoppiate a un cantilever tramite una colla epossidica nell’ambiente atmosferico, mentre le singole cellule T, a causa della loro natura non adesiva, sono funzionalizzate a un sbalzo tramite una colla biocompatibile in soluzione. Qui, descriviamo i metodi per eseguire questi due tipi di modifica a sbalzo e diamo anche due applicazioni associate. La prima applicazione è quella di sondare le interazioni tra cellule T e DC con AFM-SCFS per comprendere il meccanismo soppressivo delle cellule T regolatorie dal punto di vista della meccanica cellulare. Il secondo consiste nel combinare AFM con l’imaging a fluorescenza a cellule vive per monitorare la risposta cellulare del macrofago a una particella solida in tempo reale per rivelare il meccanismo molecolare del fosfatoindipendentene 4,5-bisphofosfatolo 4,5-bisphosphatel (PIP2)- Moesin mediava la fagocitosi. L’obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un quadro di riferimento per i ricercatori interessati per progettare e implementare le proprie impostazioni sperimentali con l’analisi unicellulare basata su AFM per la ricerca immunologica.
Protocol
Representative Results
Discussion
La spettroscopia a forza singola basata su AFM si è evoluta per essere un potente strumento per affrontare le proprietà biofisiche delle cellule viventi. Per tali applicazioni, il cantilever deve essere funzionalizzato correttamente al fine di sondare interazioni o proprietà specifiche sulle cellule di interesse. Qui, i metodi per l’accoppiamento di una singola cellula T e di un singolo tallone di dimensioni micron al cantilever senza punta sono descritti rispettivamente. Per attaccare una singola cellula T al cantile…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dal National Natural Science Foundation of China General Program (31370878), dal State Key Program (31630023) e dal Innovative Research Group Program (81621002).
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
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