Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos
Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para processar a medula fresca (BM) isolada do rato ou do ser humano para a análise de massa High-dimensional da citometria (citometria pela tempo–vôo, cytof) de pilhas da neutrófilos-linhagem.
Abstract
Neste artigo, nós apresentamos um protocolo que seja aperfeiçoado para preservar pilhas da neutrófilos-linhagem no BM fresco para a análise inteira de BM CyTOF. Nós utilizamos um painel Myeloid-tendencioso do CyTOF do 39-anticorpo para avaliar o sistema hematopoietic com um foco nas pilhas da neutrófilos-linhagem usando este protocolo. O resultado do CyTOF foi analisado com um algoritmo de redução dimensional de recurso aberto, o viSNE, e os dados foram apresentados para demonstrar o desfecho deste protocolo. Descobrimos novas populações de células de linhagem de neutrófilos com base neste protocolo. Este protocolo da preparação inteira fresca do BM pode ser usado para 1), análise de CyTOF para descobrir populações não identificadas da pilha do BM inteiro, 2), investigando defeitos inteiros do BM para pacientes com desordens de sangue tais como a leucemia, 3), auxiliando a optimização de protocolos de citometria de fluxo ativados por fluorescência que utilizam BM inteiro fresco.
Introduction
Nas últimas décadas, os métodos de citometria têm sido uma poderosa ferramenta para investigar o sistema hematopoiético na BM. Esses métodos incluem citometria de fluxo ativada por fluorescência e o novo método de CyTOF usando anticorpos com rótulo de metal pesado. Conduziram às descobertas de muitos tipos da pilha em um espécime biológico heterogêneo pela identificação de seus perfis originais da expressão do marcador de superfície. As sobreposições aumentadas do espectro que é associada com mais canaletas conduzem à inexatidão de dados mais elevada em aplicações fluorescência-ativadas da citometria do fluxo. Conseqüentemente, as pilhas indesejadas são removidas rotineiramente a fim enriquecer populações da pilha do interesse para a análise fluorescência-ativada do fluxo citometria. Por exemplo, Ly6G (ou GR-1) e CD11b são considerados marcadores de células mielóides maduros e Ly6G+ (ou GR-1+) e células CD11b+ são ROTINEIRAMENTE removidas das amostras de BM usando kits de enriquecimento magnético antes da análise de citometria de fluxo de tronco hematopoiético e células progenitoras (hspcs) ou combinando esses marcadores em um canal de coquetel de despejo1,2,3. Um outro exemplo é que os neutrófilos são removidos rotineiramente do espécime humano do sangue para enriquecer pilhas mononucleares do sangue periférico (PBMC) para estudos imunológicos. A medula óssea inteira isolada do rato ou do ser humano, entretanto, é investigada raramente intact para a análise da citometria.
Recentemente, cytof tornou-se uma ferramenta revolucionária para investigar o sistema hematopoiético4,5,6. Com CyTOF, os anticorpos etiquetados fluorophore são substituídos por anticorpos repórter-etiquetados do elemento pesado. Este método permite a medição de mais de 40 marcadores simultaneamente sem a preocupação de sobreposição de espectro. Permitiu a análise do espécime biológico intacto sem etapas da pre-depleção ou de uma canaleta da descarga. Portanto, podemos ver o sistema hematopoiético de forma abrangente com dimensionalidade de alto conteúdo a partir de parcelas convencionais de citometria de fluxo 2-D. As populações de células omitidas no passado durante o processo de depleção ou gating agora podem ser trazidas à luz com os dados de alta dimensão gerados pelo cytof4,5. Nós projetamos um painel do anticorpo que mede simultaneamente 39 parâmetros no sistema hematopoietic com um foco no linage Myeloid7. Em comparação com os dados convencionais de citometria de fluxo, a interpretação e visualização dos dados de células unidimensionais sem precedentes gerados pela CyTOF é um desafio. Os cientistas computacionais desenvolveram técnicas de redução de dimensionalidade para a visualização de conjuntos de dados de alta dimensão. Neste artigo, utilizamos o algoritmo viSNE, que utiliza a técnica t-Distributed Stochastic Neighbor incorporação (t-SNE) para analisar os dados CyTOF e apresentar o resultado de alta dimensão em um mapa de 2 dimensões, conservando a estrutura de alta dimensão dos dados8,9,10. No gráfico tSNE, células semelhantes são agrupadas em subconjuntos e a cor é usada para realçar o recurso das células. Por exemplo, na Figura 1 as células mielóides são distribuídas em vários subconjuntos de células com base nas semelhanças de seus padrões de expressão de 33 marcadores de superfície resultantes de cytof (Figura 1)4. Aqui nós investigamos a medula do osso do rato com nosso painel previamente relatado do CyTOF do 39-Marker pela análise7de visne. a análise de visne de nossos dados de cytof revelou uma população não identificada da pilha que mostrasse características de hspc (CD117+) e de neutrófilos (Ly6G+) (Figura 2)7.
Em conclusão, nós apresentamos um protocolo para processar a medula inteira fresca do osso para a análise de CyTOF. Neste artigo, nós usamos a medula óssea do rato como um exemplo, quando este protocolo puder igualmente ser usado para processar amostras humanas da medula. Os detalhes específicos para amostras de medula óssea humana também são observados no protocolo. A vantagem deste protocolo é que contem detalhes tais como o tempo e a temperatura da incubação que foram aperfeiçoados para preservar pilhas da neutrófilos-linhagem na medula inteira para permitir a investigação na medula inteira intacta do osso. Este protocolo também pode ser facilmente modificado para aplicações de citometria de fluxo ativada por fluorescência.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nas últimas décadas, a citometria de fluxo à base de fluorescência foi utilizada como método principal para estudar linhagens celulares e heterogeneidade1,2,3. Embora a citometria de fluxo tenha fornecido dados multidimensionais, este método é limitado por opções de parâmetros e sobreposição espectral. Para superar a fraqueza do fluxo citometria nós aproveitamos de cytof, que usa isótopos do metal pesado em vez dos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao núcleo de citometria de fluxo LJI para assistência com procedimento de citometria de massas. Este trabalho foi apoiado por NIH Grants R01HL134236, P01HL136275, e R01CA202987 (all to C. C. H) e ADA7-12-MN-31 (04) (para C.C.H. e Y. P. Z).
Materials
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
References
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