Studere organelle Dynamics in B Cells under immune synapse formasjon
Summary
Heri beskriver vi to tilnærminger for å karakterisere celle polarisering hendelser i B-lymfocytter under dannelsen av en IS. Den første, innebærer kvantifisering av organelle rekruttering og cytoskeleton rearrangements på Synaptic membranen. Den andre er en biokjemiske tilnærming, for å karakterisere endringer i sammensetningen av centrosome, som gjennomgår polarisering til immun synapse.
Abstract
Anerkjennelse av overflate-bundet antigener av B-cellen reseptor (BCR) utløser dannelsen av en immun synapse (IS), der både signalering og antigen opptak koordineres. IS formasjon innebærer dynamisk utgangen remodeling ledsaget av polarisert rekruttering til Synaptic membranen av centrosome og tilhørende intracellulære organeller som lysosomer og Golgi apparatet. Innledende stadier av utgangen remodeling tillate B-celler for å øke sin celle overflate og maksimere mengden av antigen-BCR komplekser samlet på synapse. Under visse forhold, når B-celler gjenkjenne antigener knyttet til stive overflater, er denne prosessen koblet til den lokale rekruttering og sekresjon av lysosomer, som kan forenkle antigen utvinning. Uptaken antigener er internalisert i spesialiserte Endo-lysosome rom for prosessering til peptider, som er lastet inn i store histocompatibility komplekse II (MHC-II) molekyler for videre presentasjon til T hjelper celler. Derfor studerer organelle dynamikk knyttet til dannelsen av en IS er avgjørende for å forstå hvordan B-celler er aktivert. I denne artikkelen vil vi diskutere både tenkelig og en biokjemiske teknikk som brukes til å studere endringer i intracellulære organelle posisjonering og cytoskeleton rearrangements som er forbundet med dannelsen av en IS i B-celler.
Introduction
B-lymfocytter er en viktig del av det adaptive immunsystemet som er ansvarlig for å produsere antistoffer mot ulike trusler og invaderende patogener. Effektiviteten av antistoff produksjon bestemmes av evnen til B-celler til å tilegne seg, behandle og presentere antigener oppstått enten i en løselig eller overflate-bundet form1,2. Anerkjennelse av antigener knyttet til overflaten av en presentasjon celle, av BCR, fører til dannelsen av en nær intercellulære kontakt betegnes er3,4. Innenfor denne dynamiske plattformen både BCR-avhengige nedstrøms signalering og internalisering av antigener i Endo-lysosome rom finner sted. Uptaken antigener er behandlet og montert på MHC-II molekyler og deretter presentert for T-lymfocytter. Produktive B-T interaksjoner, kalt B-T celle samarbeid, tillater B-lymfocytter å motta de riktige signalene, som fremmer deres differensiering i antistoff-produserende plasma celler eller minne celler8.
To mekanismer har vært involvert i antigen ekstraksjon av B-celler. Den første er avhengig av utskillelsen av proteaser stammer fra lysosomer som gjennomgår rekruttering og fusjon i Synaptic kløft5,6. Den andre, avhenger av myosin IIA-mediert trekke krefter som utløser invagination av antigen som inneholder membraner som er internalisert i clathrin-belagte groper7. Modus av antigen utvinning er avhengig av de fysiske egenskapene til membranen der antigener er funnet. Likevel, i begge tilfeller, B-celler gjennomgår to store remodeling hendelser: utgangen cytoskeleton omorganisering og polarisering av organeller til IS. Utgangen cytoskeleton remodeling innebærer en innledende spredning Stadium, der utgangen-avhengige utstikkende på Synaptic membranen øke overflaten i kontakt med antigen. Dette etterfølges av en sammentrekning fase, der bindende regler kombinert med antigener er konsentrert i sentrum av den er av samordnet handling av molekylær Motors og utgangen cytoskeleton remodeling8,9,10, 11. polarisering av organeller også avhengig av ombygging av utgangen cytoskeleton. For eksempel blir centrosome lokomotivet fra kjernen, av lokale depolymerisering av tilknyttede utgangen, som tillater omplassering av denne organelle til er5,12. I B-celler, omplassering av centrosome til en celle Pol (IS) guider lysosome rekruttering til Synaptic membranen, som ved sekresjon kan lette utvinning og/eller behandling av overflate-bundet antigener6. Lysosomer rekruttert på IS er beriket med MHC-II, som favoriserer dannelsen av peptid-MHC-II komplekser i endosomal rom for å bli presentert for T-cellene13. I tillegg har Golgi apparatet også blitt observert å være tett rekruttert til IS14, noe som tyder på at Golgi-avledet blemmer fra sekretoriske vei kan være involvert i antigen utvinning og/eller prosessering.
Alt i alt, intracellulære organelle og cytoskeleton rearrangements i B-celler under synapse formasjon er de viktigste trinnene som tillater effektiv antigen oppkjøp og behandling som kreves for deres videre aktivering. I dette arbeidet introduserer vi detaljerte protokoller om hvordan du utfører bildebehandling og biokjemiske analyser i B-celler for å studere intracellulære remodeling av organeller knyttet til dannelsen av en IS. Disse teknikkene inkluderer: (i) Immunofluorescence og bildeanalyse av B-celler aktivert med antigen-belagte perler og på antigen-belagt coverslips, som tillater visualisering og kvantifisering av intracellulære komponenter som er mobilisert til IS og (II ) isolering av centrosome-beriket fraksjoner i B-celler ved ultracentrifugation på sukrose graderinger, som gjør identifisering av proteiner knyttet til centrosome, potensielt involvert i regulering celle polaritet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en omfattende metode for å studere hvordan B-lymfocytter re-organisere sine intracellulære arkitektur for å fremme dannelsen av en IS. Denne studien omfatter bruk av Imaging teknikker for å kvantifisere den intracellulære fordelingen av organeller, som centrosome, Golgi apparater og lysosomer under B celle aktivering, og hvordan de polariserer til IS. I tillegg beskriver vi en biokjemiske tilnærming til å studere endringer i centrosome sammensetning ved B celle aktivering.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y. er støttet av et forskningsstipend fra FONDECYT #1180900. J.I., D.F. og JL ble støttet av stipend fra Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Vi takker til David Osorio fra Pontificia Universidad Católica de Chile for videoopptak og redigering.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
