Estudando a dinâmica organelle em células B durante a formação de sinapse imune
Summary
Nisto nós descrevemos duas aproximações para caracterizar eventos da polarização da pilha em linfócitos de B durante a formação de um IS. O primeiro, envolve a quantificação do recrutamento organela e rearranjos de citoesqueleto na membrana sináptica. A segunda é uma abordagem bioquímica, para caracterizar as mudanças na composição do centrosome, que sofre polarização para a sinapse imune.
Abstract
O reconhecimento de antígenos superfície-tethered pelo receptor da pilha de B (BCR) desencadeia a formação de um sinapse imune (is), onde a sinalização e a captação do antígeno são coordenadas. A formação do is envolve a remodelação dinâmica do actina acompanhada do recrutamento polarizado à membrana sináptica do centrosome e das organelas intracelular associadas tais como lisossomos e o instrumento de Golgi. Os estágios iniciais da remodelação do actina permitem que as pilhas de B aumentem sua superfície da pilha e maximizam a quantidade de complexos do antígeno-BCR recolhidos na sinapse. certas condições, quando as células B reconhecem antígenos associados a superfícies rígidas, este processo é acoplado ao recrutamento local e secreção de lisossomos, o que pode facilitar a extração do antígeno. Os antígenos uptomadas são internalizados em compartimentos Endo-lysosome especializados para processar nos peptídeos, que são carregados em moléculas principais do complexo II do histocompatibilidade (MHC-II) para uma apresentação mais adicional às pilhas do ajudante de T. Conseqüentemente, estudar a dinâmica do organela associou com a formação de um is é crucial a compreender como as pilhas de B são ativadas. No presente artigo, discutiremos a imagem e uma técnica bioquímica usada para estudar as mudanças no posicionamento da organela intracelular e nos rearranjos de citoesqueleto que estão associados à formação de um IS em células B.
Introduction
Os linfócitos B são uma parte essencial do sistema imunológico adaptativo responsável pela produção de anticorpos contra diferentes ameaças e patógenos invasores. A eficiência da produção de anticorpos é determinada pela capacidade das células B de adquirir, processar e apresentar antígenos encontrados em uma forma solúvel ou superfície-tethered1,2. O reconhecimento dos antígenos anexados à superfície de uma célula de apresentação, pelo BCR, conduz à formação de um contato intercelular próximo denominado é3,4. Dentro desta plataforma dinâmica a sinalização a jusante BCR-dependente e a internalização dos antígenos em compartimentos Endo-lysosome acontecem. Os antígenos de uptomado são processados e montados em moléculas de MHC-II e apresentados subseqüentemente aos linfócitos de T. As interações produtivas do B-T, denominadas cooperação da pilha de B-T, permitem que os linfócitos de B recebam os sinais apropriados, que promovem sua diferenciação em pilhas de plasma de produção de anticorpos ou em pilhas de memória8.
Dois mecanismos foram envolvidos na extração do antígeno por pilhas de B. A primeira conta com a secreção de proteases originadas de lisossomos que passam por recrutamento e fusão na fenda sináptica5,6. O segundo, depende das forças de tração miosina IIA-mediadas que desencadeia a invaginação do antígeno contendo membranas que são internalizadas em Poços revestidos com clathrin7. A modalidade da extração do antígeno confia nas propriedades físicas da membrana em que os antígenos são encontrados. Não obstante, em ambos os casos, as pilhas de B submetem-se a dois eventos de remodelação principais: reorganização do citoesqueleto do actina e polarização das organelas ao is. A remodelação do citoesqueleto de Actin envolve um estágio de espalhamento inicial, onde as saliências Actin-dependentes na membrana sináptica aumentam a superfície no contato com o antígeno. Isto é seguido por uma fase de contração, onde os BCRS acoplados com antígenos são concentrados no centro do é pela ação concertada de motores moleculars e do citoesqueleto do actina que remodelam8,9,10, 11. polarization das organelas igualmente confia na remodelação do cytoskeleton do actina. Por exemplo, o centrosome torna-se desacoplado do núcleo, por despolimerização local de actina associada, o que permite o reposicionamento desta organela ao is5,12. Nas células B, o reposicionamento do centrosome para um pólo celular (IS) orienta o recrutamento lisossome para a membrana sináptica, que após a secreção pode facilitar a extração e/ou processamento de antígenos de superfície-tethered6. Os lisossomas recrutados no IS são enriquecidos com MHC-II, o que favorece a formação de complexos peptídeos-MHC-II em compartimentos endossômicos a serem apresentados às células T13. Adicionalmente, o aparelho de Golgi também tem sido observado para ser estreitamente recrutado para o IS14, sugerindo que as vesículas derivadas de Golgi da via secretora poderiam estar envolvidas na extração e/ou processamento de antígenos.
Completamente, os rearranjos intracelular do organela e do citoesqueleto em pilhas de B durante a formação do sinapse são as etapas chaves que permitem a aquisição e o processamento eficientes do antígeno exigidos para sua ativação mais adicional. Neste trabalho apresentamos protocolos detalhados sobre como realizar exames de imagem e bioquímica em células B para estudar a remodelação intracelular de organelas associadas à formação de um IS. Essas técnicas incluem: (i) imunofluorescência e análise de imagens de células B ativadas com grânulos revestidos por antígeno e em coberturas revestidas com antígeno, o que permite a visualização e quantificação de componentes intracelulares que são mobilizados para o IS e (II ) isolamento de frações enriquecidas centrosome em células B por ultracentiogação em gradientes de sacarose, o que permite a identificação de proteínas associadas ao centrosome, potencialmente envolvidas na regulação da polaridade celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos um método detalhado para estudar como os linfócitos de B re-organizam sua arquitetura intracelular para promover a formação de um is. Este estudo inclui o uso de técnicas de imagem para quantificar a distribuição intracelular de organelas, como centrosoma, aparato de Golgi e lisossomas durante a ativação da célula B, e como elas se polarizam com o IS. Adicionalmente, nós descrevemos uma aproximação bioquímica para estudar mudanças na composição do centrosome em cima da ativação da pilh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y. é apoiado por uma subvenção de pesquisa da FONDECYT #1180900. J.I., D.F. e JL foram apoiados por bolsas do Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Agradecemos a David Osorio da Pontificia Universidad Católica de Chile pela gravação e edição de vídeo.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
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