Oversættelse af Ribosome affinitets rensning (TRAP) for RNA-isolation fra endotelceller in vivo
Summary
Vi præsenterer en tilgang til at rense ribosome-bundet mRNA fra vaskulære endotelceller (ECs) direkte i mus hjerne, lunge og hjerte væv via EF-specifik genetisk tag af forstærket grønt fluorescens protein (EGFP) i ribosomer i kombination med RNA rensning .
Abstract
Mange undersøgelser har været begrænset til at anvende in vitro cellulære assays og hele væv eller isolering af specifikke celletyper fra dyr til in vitro-analyse af transkriptomer og genekspression ved qPCR og RNA Sequencing. Omfattende transkriptomer og analyse af genekspression af specifikke celletyper i komplekse væv og organer vil være afgørende for at forstå cellulære og molekylære mekanismer, hvorved gener reguleres, og deres tilknytning til vævs homøostase og organ Funktioner. I denne artikel viser vi metoden til isolering af ribosome-bundet RNA direkte in vivo i den vaskulære endotelas af dyre lunger som et eksempel. De specifikke materialer og procedurer for vævs behandling og RNA-rensning vil blive beskrevet, herunder vurdering af RNA-kvalitet og-udbytte samt realtids qPCR for arteriogene gen-assays. Denne fremgangsmåde, kendt som at oversætte ribosom affinitets rensning (Trap) teknik, kan udnyttes til karakterisering af genekspression og transkriptomanalyse af visse celletyper direkte in vivo i enhver specifik type i komplekse væv.
Introduction
I komplekse væv som pattedyr hjernen, hjertet og lungerne komplicerer de høje niveauer af cellulær heterogenitet analysen af data fra Gen-ekspression, som stammer fra hele vævsprøver. For at observere profiler for genekspression i en bestemt celletype in vivo er der for nylig udviklet en ny metodologi, som gør det muligt at forhør hele det oversatte mRNA-komplement af enhver genetisk defineret celletype. Denne metode er kendt som oversætte ribosom affinitet rensning (fælde) teknik1,2. Det er et nyttigt værktøj til at studere endotel cellebiologi og angiogenese, når det kombineres med genetisk manipulerende andre angiogenese-associerede gener i dyr.
Vi har vist, at angiogen PKD-1 signalering og transkriptionen af angiogen gen CD36 er afgørende for endotelcelle (EC) differentiering og funktionelle angiogenese3,4,5,6. For at bestemme molekylære mekanismer af angiogen og metabolisk signalering i gentransskription og EF-Trans differentiering har vi skabt genetisk manipulerede FÆLDE mus med specifikt slettede angiogene gener på grundlag af TRAP Technique1 , 2. Desuden, i vores fælde dyr, ikke kun har de PKD-1 eller CD36 gen mangel i den vaskulære endothelia eller global sletning af CD36 gen, men et forbedret grønt fluorescens protein (egfp) er også genetisk tagget på EF’S oversættelse af ribosomer. TRAP tillader affinitet rensning af ribosome-bundet mRNA direkte fra den vaskulære endothelia af målrettede væv, muliggør analyse af genekspression og identifikation af nye transkriptomer, der er forbundet med EF-differentiering og angiogenese direkte under in vivo-betingelser. Vi har med succes isoleret ribosome-bundet RNA fra endothelia i disse genetisk manipulerede dyr. Det rensede RNA kan anvendes til yderligere karakterisering af angiogene eller arteriogene gener i reguleringen af EF-differentiering og-funktioner. Denne protokol giver en trinvis vejledning til gennemførelse af FÆLDEN tilgang til isolering af mRNA i ECs direkte in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angiogenese er en kompleks flertrinsproces, hvor EF-specifik angiogen gen transskription og udtryk spiller en væsentlig rolle i EF-differentiering og angiogen omprogrammering3,4. For at overvinde barriererne fra den cellulære mangfoldighed og arkitektoniske kompleksitet for bedre at forstå funktionen af det pattedyrs vaskulære system på molekylært niveau in vivo, har vi skabt EF-specifikke TRAP-mus, ledsaget af EF-specifikke CD36 , EF-specifik …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Ren’s arbejde er støttet af American Heart Association (13SDG14800019; BR), ann’s Hope Foundation (FP00011709; BR), American Cancer Society (86-004-26; MCW Cancer Center til BR), og National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan palmer understøttes af 2018 MCW CTSI 500 Stars Internship-programmet; P. Moran understøttes af et institutionelt forsknings uddannelses stipendium fra NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?. Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
