Traduzindo a purificação de afinidade Ribossome (TRAP) para isolamento de RNA de células endoteliais in vivo

Summary

Nós apresentamos uma aproximação para purificar o mRNA ribosome-ligado das pilhas endothelial vasculares (ECS) diretamente no cérebro do rato, nos tecidos do pulmão e do coração através do Tag genético EC-specific da proteína verde aumentada da fluorescência (EGFP) nos ribossomas em combinação com a purificação do RNA .

Abstract

Muitos estudos têm sido limitados ao uso de ensaios celulares in vitro e tecidos inteiros ou isolando tipos de células específicas de animais para análise in vitro de transcriptoma e expressão gênica por sequenciamento de qPCR e RNA. O transcriptoma detalhado e a análise da expressão de gene de tipos específicos da pilha em tecidos e em órgãos complexos serão críticos compreender os mecanismos celulares e moleculars por que os genes são regulados e sua associação com a homeostase e o órgão do tecido Funções. Neste artigo, nós Demonstramos a metodologia para a isolação do RNA ribosome-ligado diretamente in vivo no endothelia vascular de pulmões animais como um exemplo. Os materiais e os procedimentos específicos para o processamento do tecido e a purificação do RNA serão descritos, incluindo a avaliação da qualidade e do rendimento do RNA assim como qPCR do tempo real para ensaios arteriogênica do gene. Esta aproximação, conhecida como traduzindo a técnica Ribossoma da purificação da afinidade (armadilha), pode ser utilizada para a caracterização da expressão de gene e da análise do transcriptoma de determinados tipos da pilha diretamente in vivo em todo o tipo específico em tecidos complexos.

Introduction

Em tecidos complexos, como o cérebro de mamíferos, coração e pulmão, os altos níveis de heterogeneidade celular complicam a análise dos dados de expressão gênica derivados de amostras de tecidos inteiros. Para observar os perfis de expressão gênica em um determinado tipo de célula in vivo, uma nova metodologia foi desenvolvida recentemente, o que permite a interrogação de todo o complemento traduzido de mRNA de qualquer tipo de célula geneticamente definida. Essa metodologia é conhecida como a técnica de conversão de afinidade Ribossome (Trap)^1,2. É uma ferramenta útil para estudar a biologia e a angiogênese de células endoteliais quando combinada com a manipulação genética de outros genes associados à angiogênese em animais.

Nós mostramos que a sinalização angiogênica de PKD-1 e a transcrição do gene angiogénico CD36 são críticas para a diferenciação da pilha endothelial (EC) e a angiogênese funcional^3,4,5,6. Para determinar os mecanismos moleculares da sinalização angiogênica e metabólica na transcrição genética e na transdiferenciação CE, criamos camundongos TRAP geneticamente modificados com genes angiogênicos especificamente excluídos com base na técnica TRAP^{1 , 2}. Além disso, em nossos animais Trap, não só eles têm deficiência de gene PKD-1 ou CD36 no endothelia vascular ou apagamento global do gene CD36 , mas uma proteína de fluorescência verde reforçada (EGFP) também é geneticamente marcada para A EC está traduzindo ribossomas. A armadilha permite a purificação da afinidade do mRNA ribosome-ligado diretamente do endothelia vascular de tecidos alvejados, permitindo a análise da expressão de gene e da identificação de transcriptoma novos que são associados com a diferenciação e angiogênese diretamente condições in vivo. Nós isolamos com sucesso o RNA ribosome-ligado do endothelia nestes animais genetically projetados. O RNA purificado pode ser utilizado para a caracterização de genes angiogênicos ou arteriogênicos na regulação da diferenciação e funções da CE. Este protocolo fornece um guia passo a passo para implementar a abordagem TRAP para o isolamento de mRNA em ECs diretamente in vivo.

Protocol

Para experimentos com animais, todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina de Wisconsin. 1. Prepare os reagentes Prepare o tampão de Lise para concentrações de 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mm dtt, 100 mg/ml cicloheximida, inibidores da protease e inibidores de RNase recombinantes para concentrações como descrito abaixo. Adicione os seguintes reagentes a 50…

Representative Results

Nossos estudos precedentes4,7 sugerem que CD36 possa funcionar como um interruptor para a diferenciação arteriolar e a arterialização capilar através da via de sinalização de LPA/PKD-1. Para estudar se o eixo de sinalização LPA/PKD-1-CD36 é essencial para a arteriogênese in vivo, estabelecemos as novas linhas TRAP que não só têm deficiência global de CD36 ou deficiência endotelial-específica-CD36-ou PKD-1, mas também permitem o isolamento seleti…

Discussion

A angiogênese é um processo complexo de múltiplas etapas, no qual a transcrição e expressão do gene angiogênico específico da CE desempenham um papel essencial na diferenciação da CE e na reprogramação angiogênica^3,4. Para superar as barreiras da diversidade celular e da complexidade arquitetônica para melhor compreender a função do sistema vascular de mamíferos em nível molecular in vivo, criamos camundongos TRAP específicos da CE, acompanhado…

Materials

2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips	Agilent	G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
Cell scrapers	Sarstedt	83.1832
Homogenizers	Fisher Scientific	K8855100020
Magnet (Dynamag-2)	Invitrogen	123-21D	Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2
Minicentrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
NanoDrop 2000C spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000C
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5430R	with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes
RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes	Applied Biosystems	AM12450
Rnase-free 50-mL conical tubes	Applied Biosystems	AM12501
RNase-free 1000-μl filter tips	Rainin	RT-1000F
RNase-free 200-μl filter tips	Rainin	RT-200F
RNase-free 20-μl filter tips	Rainin	RT-20F
Rotor for homogenizers	Yamato	LT-400D
Tube rotator, Labquake brand	Thermo Fisher	13-687-12Q