Summary

بروتوكول في المختبر لتقييم مستويات MicroRNA، وظائف، والجينات المستهدفة المرتبطة بها في الخلايا السرطانية

Published: May 21, 2019
doi:

Summary

ويستخدم هذا البروتوكول تفاعلاً متسلسلاً للبوليميراز في الوقت الحقيقي القائم على المسبار، ومسباراً من نوع سولفورهوامين B (SRB)، واستنساخ 3 مناطق غير مترجمة (3′ UTR)، وإمكانية اختبار لوسيفيراز للتحقق من الجينات المستهدفة لميرنا ذات الأهمية ولفهم وظائف الميرنا.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) هي RNAs التنظيمية الصغيرة التي يتم التعرف عليها لتعديل العديد من مسارات الإشارات داخل الخلايا في العديد من الأمراض بما في ذلك السرطان. وتتفاعل هذه التقييمات التنظيمية الصغيرة أساساً مع المناطق غير المترجمة البالغ عددها 3 مناطق (3′ من جمهورية ترانسبورت) من الرسل المستهدفين (mRNAs) مما أدى في نهاية المطاف إلى تثبيط عمليات فك رموز الـ mRNAs وزيادة تحلل الحمض اتّصال اتّصاليّة الهدف. استناداً إلى مستويات التعبير والوظائف داخل الخلايا، miRNAs قادرة على أن تكون بمثابة عوامل تنظيمية من mRNAs oncogenic والورم المثبطة. تحديد الجينات المستهدفة حسن النية من ميرنا بين مئات أو حتى الآلاف من الأهداف المتوقعة حسابيا هو خطوة حاسمة لتمييز الأدوار والآليات الجزيئية الأساسية لميرنا من الفائدة. تتوفر العديد من برامج التنبؤ بالأهداف miRNA للبحث عن تفاعلات ميرنا-ميرنا المحتملة. ومع ذلك، فإن السؤال الأكثر تحديا هو كيفية التحقق من صحة الجينات المستهدفة المباشرة من ميرنا ذات الفائدة. يصف هذا البروتوكول استراتيجية قابلة للاستنساخ من الأساليب الرئيسية حول كيفية تحديد أهداف ميرنا المتعلقة بوظيفة ميرنا. يقدم هذا البروتوكول دليلاً عملياً على الإجراءات خطوة بخطوة للكشف عن مستويات ميرنا، والوظائف، وما يتصل بها من mRNAs الهدف باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل القائم على المسبار في الوقت الحقيقي (PCR)، اختبار sulforhodamine B (SRB) بعد اختبار محاكاة ميرنا للانف ، توليد منحنى الجرعة والاستجابة، والاختبار لوسيفيراز جنبا إلى جنب مع استنساخ 3 ‘UTR من الجين، وهو أمر ضروري لفهم صحيح لأدوار miRNAs الفردية.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) هي RNAs التنظيمية الصغيرة التي تعدل بشكل رئيسي عملية ترجمة وتدهور RNAs رسول (mRNAs) عن طريق الرد على 3 ‘المناطق غير المترجمة (3’ UTR) في الجينات المستهدفة حسن النية1. ويمكن تنظيم التعبير عن الـ miRNAs من خلال آليات النسخ وما بعد النسخ. عدم التوازن في هذه الآليات التنظيمية يجلب مستويات التعبير miRNAs غير المنضبط والمميزة في العديد من الأمراض بما في ذلك السرطانات2. يمكن أن يكون لميرنا واحد تفاعلات متعددة مع mRNAs متنوعة. وفي المقابل، يمكن التحكم في الميرنا الفردية من قبل العديد من miRNAs. لذلك، تتأثر شبكات الإشارات داخل الخلايا بشكل معقد بـ miRNAs التي يتم من خلالها بدء الاضطرابات والأمراض الفسيولوجية وتدهورها 5 , 6.على الرغم من أن التعبير المتغير من miRNAs لوحظ في أنواع مختلفة من السرطانات، والآليات الجزيئية التي تعدل آداب الخلايا السرطانية جنبا إلى جنب مع miRNAs لا تزال غير معروفة إلى حد كبير.

وقد أظهرت الأدلة المتراكمة أن الأدوار الأورامأو المثبطة للأورام من miRNAs تعتمد على أنواع السرطانات. على سبيل المثال، من خلال استهداف مربع forkhead o3 (FOXO3)، miR-155 يعزز انتشار الخلايا، والنقي، والمقاومة الكيميائية لسرطان القولون والمستقيم7،8. وعلى النقيض من ذلك، فإن تقييد غزو الخلايا الدبقية يسببه miR-107 عن طريق تنظيم البروتين المتجانس من الدرجة العصبية locus 2 (NOTCH2) التعبير9. تقييم التفاعلات ميرنا الهدف فيما يتعلق وظائف ميرنا هو جزء لا غنى عنه لفهم أفضل كيف miRNAs تنظيم العمليات البيولوجية المختلفة في كل من الدول الصحية والمرضى10. وبالإضافة إلى ذلك، فإن اكتشاف هدف (أهداف) حسن النية من miRNAs يمكن أن توفر كذلك استراتيجية دقيقة لضبطها لعلاج يستند إلى ميرنا مع مختلف الأدوية المضادة للسرطان. ومع ذلك، فإن التحدي الرئيسي في مجال التقييمات الوطنية للجمهورية الإسلامية هو تحديد الأهداف المباشرة للجمهورية. هنا، يتم تقديم أساليب مفصلة كنهج تجريبية قابلة للاستنساخ لتحديد الجينات الهدف ميرنا. وينطوي التصميم التجريبي الناجح لتحديد هدف ميرنا علىخطوات واعتبارات مختلفة (الشكل 1). مقارنة مستويات ميرنا الناضجة في الخلايا السرطانية والخلايا الطبيعية يمكن أن تكون واحدة من الإجراءات الشائعة لاختيار ميرنا ذات الأهمية (الشكل1A). الدراسة الوظيفية لميرنا مختارة للكشف عن آثار ميرنا على انتشار الخلايا من المهم لتضييق قائمة أفضل الأهداف المرشحة المحتملة من ميرنا ذات الفائدة (الشكل1B). واستناداً إلى الوظائف التي تم التحقق من صحتها تجريبياً لـ miRNAs، يلزم إجراء مراجعة منهجية للمؤلفات وقاعدة البيانات في الشركة التي لها برنامج التنبؤ المستهدف بالحمض النووي الريبي (MIRNA) للبحث عن المعلومات الأكثر صلة بوظائف الجينات (الشكل1C). ويمكن تحقيق تحديد الجينات المستهدفة الحقيقية لميرنا ذات الأهمية من خلال تنفيذ تجارب مثل اختبار لوسيفيراز جنبا إلى جنب مع استنساخ 3 ‘UTR من الجينات، PCR في الوقت الحقيقي، والنشاف الغربي (الشكل1D). والهدف من البروتوكول الحالي هو توفير أساليب شاملة للتجارب الرئيسية، وتفاعل البوليميراز المتسلسل القائم على المسبار في الوقت الحقيقي، والاختبار بسولفورهوامين B (SRB) بعد أن تحاكي ميرنا عمليات الانحراف، وتوليد منحنى الجرعة والاستجابة، و لوسيفيراز اختبار جنبا إلى جنب مع استنساخ 3 ‘UTR من جين. البروتوكول الحالي يمكن أن تكون مفيدة لفهم أفضل لوظائف miRNAs الفردية والآثار المترتبة على ميرنا في علاج السرطان.

Protocol

1. ناضجة ميكرورنا (ميرنا) تحليل التعبير ناضجة ميرنا الحمض النووي التكميلي (cDNA) التوليف إضافة 254 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي و 4.5 ميكرولتر من خليط ديوكسيريبونوكليس الأول (DNase I)، ثم إضافة المياه النقية جداً في أنابيب قطاع PCR لتعويض ما يصل إلى 18 ميكرولتر (الشكل<strong…

Representative Results

ومن المهم أن يكون التأكيد الناجح والدقيق لمستويات ميرنا مهماً لتفسير البيانات التي يمكن من خلالها تصنيف الميرنا على أساس الأدوار المتوقعة لـ miRNAs في تطور المرض وتطوره. تم قياس مستويات ميرنا-107 وميرنا-301 في ثلاثة خطوط خلايا البنكرياس باستخدام PCR الكمي القائم على التحقيق. يمكن أن يزيد تركيب cDN…

Discussion

استراتيجيات لتحديد أهداف ميرنا حسن النية مع وظائف ميرنا ذات الأهمية لا غنى عنها لفهم الأدوار المتعددة للميرنا. يمكن أن يكون تحديد الجينات المستهدفة ميرنا مبدأ ً توجيهياً لتفسير أحداث إشارات الخلية التي تم تضمينها بواسطة miRNAs في الخلية. الكشف عن الجينات المستهدفة الهامة وظيفيا من miRNAs يمكن …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج بحوث العلوم الأساسية من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من وزارة التعليم (2017R1D1A3B03035662)؛ وصندوق بحوث جامعة هاليم، 2017 (HRF-201703-003).

Materials

15 mL conical tube SPL Life Sciences 50015
24-well plate Thermo Scientific 142475
50 mL conical tube SPL Life Sciences 50050
6-well plate Falcon 353046
6X DNA loading dye Real Biotech Corporation RD006 1 mL
8-cap strip Applied Biosystems N8010535 For cDNA synthesis
8-tube strip Applied Biosystems N8010580 For cDNA synthesis
96-well plate Falcon 353072
Acetic acid Sigma A6283-1L 1 L
Agarose A Bio Basic D0012 500 g
Alkaline phosphatase New England Biolabs M0290S 10,000 U/mL
Ampicillin Bio basic Canada Inc AB0028 25 g
AriaMx 96 tube strips Agilent Technologies 401493 For real time PCR
AriaMx real-time PCR system Agilent Technologies G8830A qPCR amplification, detection, and data analysis
AsiSI New England Biolabs R0630 10,000 units/mL
CAPAN-1 cells ATCC HTB-79
Cell culture hood Labtech Model: LCB-1203B-A2
Counting chambers with V-slash Paul Marienfeld 650010 Cells counter
CutSmart buffer New England Biolabs B7204S 10X concentration
DMEM Gibco 11965-092 500 mL
DNA gel extraction kit Bionics DN30200 200 prep
DNA ladder NIPPON Genetics EUROPE MWD1 1 Kb ladder
DNase I Invitrogen 18068015 100 units
Dual-luciferase reporter assay system Promega E1910 100 assays
Fetal bovine serum Gibco 26140-079 500 mL
HIT competent cells Real Biotech Corporation(RBC) RH617 Competent cells
HPNE cells ATCC CRL-4023
LB agar broth Bio Basic SD7003 250 g
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 0.75 mL
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-075 0.75 mL
Luminometer Promega Model: E5311
Microcentrifuge tube Eppendorf 22431021
Microplate reader TECAN Infinite F50
miRNA control mimic Ambion 4464058 5 nmole
miRNA-107 mimic Ambion 4464066 5 nmole
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 50 prep
Mupid-2plus (electrophoresis system) TaKaRa Model: AD110
NotI New England Biolabs R3189 20,000 units/mL
Oligo explorer program GeneLink For primer design
Optical tube strip caps (8X Strip) Agilent Technologies 401425 For real time PCR
Opti-MEM Gibco 31985-070 500 Ml
PANC-1 cells ATCC CRL-1469
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122 100 mL
Phosphate buffer saline Gibco 14040117 1000 mL
Plasmid DNA miniprep S& V kit Bionics DN10200 200 prep
PrimeSTAR GXL DNA polymerase TaKaRa R050A 250 units
Shaker TECAN Shaking platform
Shaking incubator Labtech Model: LSI-3016A
Sigmaplot 14 software Systat Software Inc For dose-response curve generation
Sulforhodamine B powder Sigma S1402-5G 5 g
SYBR green master mix Smobio TQ12001805401-3 Binding fluorescent dye for dsDNA
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A 25,000 U
TaqMan master mix Applied Biosystems 4324018 200 reactions, no AmpErase UNG
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan miR RT kit Applied Biosystems 4366597 1000 reactions
Thermo CO2 incubator (BB15) ThermoFisher Scientific 37 °C and 5% CO2 incubation
Trichloroacetic acid Sigma 91228-100G 100 g
Trizma base Sigma T4661-100G 100 g
Ultrapure water Invitrogen 10977-015 500 mL
Veriti 96 well thermal cycler Applied Biosystems For amplification of DNA (or cDNA)
XhoI New England Biolabs R0146 20,000 units/mL

References

  1. He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
  2. Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  3. Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
  4. Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
  5. Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
  6. Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
  7. Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
  8. Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
  9. Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
  10. Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
  11. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
  12. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  15. Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
  16. Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
  17. Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
  18. van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
  19. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
  20. Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
  21. Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
  22. Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
  23. Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
  24. Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
  25. Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
  26. Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
  27. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
  28. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
  29. Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
  30. Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
  31. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  32. Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
  33. Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
  34. Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. 암 연구학. 70 (2), 440-446 (2010).
  35. Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).

Play Video

Cite This Article
Seo, H. A., Hwang, C. Y., Moeng, S., Park, J. K. An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells. J. Vis. Exp. (147), e59628, doi:10.3791/59628 (2019).

View Video