En in vitro-protokol til evaluering af MicroRNA-niveauer, funktioner og tilknyttede Målgener i tumor celler
Summary
Denne protokol bruger en Probe-baseret real-time polymerase kædereaktion (PCR), en sulforhodamin B (SRB) assay, 3 ‘ ikke oversat regioner (3 ‘ UTR) kloning, og en der analyse for at verificere målgener af en Mirna af interesse og til at forstå funktionerne i Mirnas.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er små regulerende RNAs, som er anerkendt for at modulere talrige intracellulære signalering veje i flere sygdomme, herunder kræft. Disse små regulerende RNAs interagerer primært med de 3 ‘ ikke-oversatte regioner (3 ‘ UTR) af deres Target Messenger RNAs (mRNAs) i sidste ende resulterer i hæmning af dekodning processer af mRNAs og augmentation af Target mRNA nedbrydelser. Baseret på udtryks niveauer og intracellulære funktioner, miRNAs er i stand til at fungere som regulerende faktorer af onkogen og tumor-suppressiv mRNAs. Identifikation af bona fide Target gener af en miRNA blandt hundredvis eller endda tusinder af beregningsmæssigt forudsagte mål er et afgørende skridt til at skelne mellem roller og grundlæggende molekylære mekanismer af en miRNA af interesse. Forskellige miRNA Target forudsigelse programmer er tilgængelige for at søge mulige miRNA-mRNA interaktioner. Men det mest udfordrende spørgsmål er, hvordan man validerer direkte Target gener af en miRNA af interesse. Denne protokol beskriver en reproducerbar strategi med nøgle metoder til, hvordan man identificerer miRNA-mål i forbindelse med en miRNA-funktion. Denne protokol indeholder en praktisk vejledning om trinvise procedurer til at afdække Mirna-niveauer, funktioner og relaterede mRNAs-mål ved hjælp af den Probe baserede realtids polymerasekædereaktion (PCR), sulforhodamin B (SRB) assay efter en Mirna efterligne transfektering , dosis-respons kurve generation, og der assay sammen med kloning af 3 ‘ UTR af et gen, som er nødvendig for korrekt forståelse af de enkelte Mirnas roller.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) er de små regulerende RNAs, der primært moduter processen med oversættelse og nedbrydning af Messenger RNAs (mRNAs) ved at reagere på de 3 ‘ ikke-oversatte regioner (3 ‘ UTR) i bona fide Target gener1. Udtryk for miRNAs kan reguleres af transkriptionelle og post-transkriptionelle mekanismer. Ubalance i sådanne reguleringsmekanismer medfører ukontrollerede og karakteristiske miRNAs-udtryks niveauer i talrige sygdomme, herunder kræft2. En enkelt miRNA kan have flere interaktioner med forskellige mRNAs. Tilsvarende kan en individuel mRNA styres af forskellige miRNAs. Derfor er intracellulære signalerings netværk indviklet påvirket af karakteristisk udtrykte Mirnas, hvormed fysiologiske lidelser og sygdomme kan initieres og forværres2,3,4, 5 , 6. selv om det ændrede udtryk for Mirnas er blevet observeret i forskellige typer af kræft, de molekylære mekanismer, der modunere manerer af kræftceller i forbindelse med Mirnas er stadig stort set ukendte.
Akkumulerende beviser har vist, at de onkogene eller tumor-suppressiv roller miRNAs afhænger af de typer af kræft. For eksempel, ved at målrette forkhead box O3 (FOXO3), miR-155 fremmer celle proliferation, metastase, og chemoresistance af kolorektal cancer7,8. I modsætning hertil er begrænsningen af gliom celle invasion induceret af miR-107 via reguleringen af neurogen locus notch ligner protein 2 (NOTCH2) udtryk9. Vurderingen af miRNA-Target-interaktioner i forbindelse med miRNA-funktioner er en uundværlig del for bedre at forstå, hvordan miRNAs regulerer forskellige biologiske processer i både raske og syge stater10. Desuden kan opdagelsen af bona fide mål (r) af miRNAs yderligere give en finjusteret strategi for en miRNA-baseret terapi med forskellige anti-cancer narkotika. Den største udfordring i miRNAs-området er imidlertid at identificere de direkte mål for miRNAs. Her præsenteres detaljerede metoder som reproducerbare eksperimentelle tilgange til miRNA Target gen bestemmelse. Vellykket eksperimentel design for miRNA Target identifikation involverer forskellige trin og overvejelser (figur 1). Sammenligning af modne miRNA niveauer i tumorceller og normale celler kan være en af de fælles procedurer for at vælge en miRNA af interesse (figur 1a). Den funktionelle undersøgelse af en udvalgt miRNA til at påvise virkningerne af en miRNA på celle spredning er vigtigt at indsnævre listen over de bedste potentielle kandidat mål for en miRNA af interesse (figur 1b). Baseret på miRNAs eksperimentelt validerede funktioner kræves der en systematisk gennemgang af litteratur og database i selskab med et miRNA Target-forudsigelses program for at søge de mest relevante oplysninger om genfunktioner (figur 1c). Identifikationen af reelle mål gener af en Mirna af interesse kan opnås ved at gennemføre eksperimenter såsom der assay sammen med kloning af 3 ‘ UTR af et gen, real-time PCR, og Western blotting (figur 1d). Formålet med den nuværende protokol er at tilvejebringe omfattende metoder til nøgle eksperimenter, den sonde baserede realtids polymerasekæde reaktion (PCR), sulforhodamin B (SRB) assay efter en Mirna efterligne transfection, dosis-respons kurve generering og der assay sammen med kloning af 3 ‘ UTR af et gen. Den nuværende protokol kan være nyttig for en bedre forståelse af de enkelte miRNAs funktioner og konsekvenserne af en miRNA i kræftbehandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strategier til bestemmelse af bona fide miRNA mål med funktionerne i en miRNA af interesse er uundværlige for forståelsen af flere roller miRNAs. Identifikation af miRNA Target gener kan være en retningslinje for fortolkning af celle signalering hændelser moduleret af miRNAs i en celle. En afsløring af funktionelt vigtige mål gener af miRNAs kan give den grundlæggende viden til at udvikle en miRNA-baseret terapi i kræft.
Flere metoder såsom mikroarrays, lille RNA-Biblioteks sekvenser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af grundlæggende videnskabelige forsknings program gennem National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af Undervisningsministeriet (2017R1D1A3B03035662); og Hallym Universitets forskningsfond, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. 암 연구학. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
